siRNA体内递送的高强度极限大小脂质纳米颗粒的微流合成

脂质纳米颗粒（LNP）是体内领先的系统交付用于治疗应用的小干扰RNA（siRNA）。LNP siRNA系统的配制需要将含有阳离子脂质的溶液与含有siRNA的溶液快速混合。当前的配制程序采用宏观混合工艺来生产直径70 nm或更大的系统，这些系统具有可变的siRNA封装效率，均质性和可重复性。在这里，我们显示了允许在纳升级进行毫秒混合的微流体混合技术，可重复生成极限大小为20 nm或更大的LNP siRNA系统，并在多态性指数低至0.02的广泛条件下基本上完全包封了siRNA。通过微流混合产生的优化的LNP siRNA系统在小鼠肝细胞中以10 µg / kg siRNA的剂量水平实现了50％的靶基因沉默。

脂质纳米颗粒（LNP）是治疗应用中用于体内递送小干扰RNA（siRNA）的主要系统。LNP siRNA系统可以在多种动物模型中通过静脉注射沉默治疗相关基因，并且正在临床试验中用于心血管疾病、肝癌和其他疾病的治疗。目前已经开发了几种制造LNP siRNA的方法，包括将预先形成的囊泡（PFVs）与siRNA混合或使用T型管混合器将溶解在乙醇中的脂质与siRNA水溶液混合。这些方法产生直径为70nm或更大的LNP，其siRNA封装效率为65-95%。然而，由于宏观混合方法会导致局部混合速率不均匀，因此往往会产生具有高多分散性和批间重复性差的LNP。微流控混合技术允许毫秒级纳升级别的快速混合，在本文中我们展示了利用微流控混合技术来可靠地制备之前无法实现的LNP siRNA系统。我们采用了简单但高效的微流控设备——交错人字形微混合器（SHM），相对于其他微混合器几何结构具有更高产量，使其适用于大规模生产LNP-siRNA。

微流体混合导致单分散LNP的产生。
结构化混沌平流（SHM）提供了一种在中等雷诺数条件下（2 < Re < 500）对两个输入流进行可重复和非常快速混合的方法。在将两个流体流组合后，它们通过一系列人字形结构，诱导旋转流，使得流体相互包裹，并且方向在半个周期之间变化。这导致了一个混沌的流动特征，其特点是指数级地缩小了两个液体之间的特征扩散长度，并实现了快速的平流混合。当总流量为2毫升/分钟时，本文采用的SHM可以在3ms内实现完全混合。

为了开发LNP siRNA的制造工艺，我们采用了基于先前研究的测试配方，其中使用PFV和T管混合工艺制备LNP-siRNA系统。脂质组成包括可离子化阳离子脂质(DLinKC2-DMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇和PEG-lipid，其中阳离子脂质含量范围为40至60 mol%，PEG-lipid含量为1至5 mol%。siRNA/总脂质比保持在0.06 (wt/wt)。DLinKC2-DMA具有明显pKa值为6.76，在低pH（例如pH 4.0）下能够与siRNA形成复合物，并且在生理pH下使LNP表面电荷接近中性，从而减少毒副作用。测试配方由DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA按40:11.5:47.5:1摩尔比组成，并且siRNA/lipid比例为0.06 (wt/wt)。随后改变PEG-lipid含量、阳离子脂质含量和/或siRNA/lipid比例以优化LNP尺寸或效力。

我们首先研究了自组装混合（SHM）在一系列溶质浓度下，是否能够产生具有确定大小的单分散LNP siRNA系统。我们假设，在足够快的混合速率下，由于介质极性迅速上升而沉淀形成的脂质纳米粒子(LNP)将采用与组分分子物理特性相容的Z小或“极限大小”。因此，在更快的流速下，提供逐渐缩短的混合时间，预期将产生越来越单分散的极限大小LNP siRNA系统。我们从测试配方中以总流量0.02到4 ml/min生成LNP siRNA系统。通过动态光散射测量得出，在流速高于0.2 ml/min时，LNP直径保持恒定约55 nm（数字加权模式；反映从表观LNP分子量得出的平均直径）。然而，在Z高总流速4 ml/min时，针对终端siRNA浓度范围为0.25 mg/ml至0.59 mg/ml实现了多分散性指数(PDI)为0.03或更小、高度单分散的“极限大小” LNP siRNA 系统。

微流控混合器的并行化允许LNP制造规模化。
一个可行的LNP siRNA配方过程也必须是可扩展的。由于反应总体积增加时会出现质量传输差异，因此放大规模可能具有挑战性。微流控混合的固有优势在于可以通过并行化混合设备轻松扩展（见图1b）。为了证明这一点，我们使用了一个具有六个并行SHM元件的装置来生产由1-棕榈酰基-2-油酰基PC（POPC）/胆固醇组成、每分钟72毫升或580毫克LNP/min 的极限尺寸LNP。据我们所知，这是迄今为止使用微流控方法演示的Z高速率的LNP合成，并且与替代放大工艺相比表现良好。

通过微流控混合生成的LNP siRNA系统在体内表现出强大的基因沉默作用，这是非常重要的。
我们需要证明，与以往技术生成的系统相比，这些由微流控混合产生的LNP siRNA系统具有同等或更高的效力。迄今为止，报道中Z有效的siRNA制剂是使用DLinKC2-DMA阳离子脂质，并优化了阳离子脂质比例和siRNA/脂质比值，通过T管合成制备而成的LNP系统。已经证实，在小鼠FVII模型中，这些LNP siRNA系统可以达到50%基因沉默效果，并且剂量水平低至0.02 mg siRNA/kg体重。因此，在小鼠FVII模型中首先测量了由微流控混合产生的LNP FVII-siRNA系统在不同阳离子脂质量下的基因沉默效力，并其次作为siRNA/脂质比值函数进行测定。

本研究的结果表明，微流体混合装置中含有SHM可以用于生成可预测“极限”大小的LNP系统。siRNA能够有效地封装在这些系统中，并且所产生的LNP siRNA系统在体内展现出优异的基因沉默能力。我们将此处呈现的结果与以往使用微流体混合技术形成LNP系统进行了区分，然后讨论了使用微流体混合设备形成LNP和LNP siRNA系统的机制，并Z终指出了采用SHM几何形状进行微流体混合相比以往宏观混合程序制定LNP siRNA系统时的优势。

已经做出相当大量工作来利用微流体混合（主要是通过水动力学聚焦几何）生成脂质和聚合物纳米颗粒，或者包含质粒DNA的脂质复合物。虽然结果令人鼓舞，但存在一些局限性，例如所生成材料大小和数量方面存在限制。例如，在水动力学聚焦下产生50nm直径极限尺寸系统只有在30或更高的流速比下才能实现，在这种情况下会导致较大程度上材料稀释。而我们所提供的结果则证明了SHM可以产生高量（500mg/min）符合极限尺寸范围为20-100nm LNP siRNA 系统，并且通过简单改变PEG-脂质含量即可控制其极限尺寸。

Z后值得注意到，在我们完成本文准备阶段时Chen等人发表文章指出他们也利用微流体混合技术并采用SHM 微搅拌器来小规模生产各种类型 LNP siRNA 配方, 以确定适于 vivo 传递新组分. 这项工作采用低流速(~0.3ml/min)，低封装效率(~80%) 和70-80nm 的 LNP 大小。

关于微型化过程允许形成 LNP 和包含 LNP 的siRNA 的机理问题, 我们感兴趣两个点：首先是如何形成100 nm 或更小 LNPC；其次是如何使得siRNAs 可以接近100% 封装效率。 关于LNPs 形成, 混匀速率显然是一个重要参数。乙醇 - 脂溶液与水缓冲液快速混匀导致介质极性迅速增加, 导致整个 水平达到高超饱和状态 , 结果快速均匀核化纳米颗粒 。 这些核化事件非常迅捕捉时间标度对颗粒形态/结构影响不稳定亚 极限大小颗粒 ，随后 合并 成 枝界线 大小 颗 粒子 ，由 组件 提供 的空间约束 决 定 颗 粒 子 大 小 。适 当选择 脂 类 组件 及 其 相 对 数 量 ， 其 后 控 制 扩 散进入进一步 生长。

关于微流体工艺允许LNP和含LNP的siRNA形成的机制，有两个值得关注的点：首先是形成100 nm大小或更小的LNP的机制，其次是siRNA可以以接近100%的效率被封装的机制。关于LNP的形成，混合速率显然是一个重要参数（如在本文和其他研究中所示）。乙醇-脂溶液与水缓冲液快速混合导致介质极性迅速增加，在整个混合体积内使脂质单体高度过饱和，从而迅速且均匀地产生纳米颗粒。这些核化事件比颗粒形成/聚集时间尺度快得多，并导致非热力学稳定亚限尺寸颗粒的形成。随后这些亚限尺寸颗粒会凝聚形成限定尺寸颗粒，而颗粒大小由提供组分所施加出来的空间位阻和能量约束决定。适当选择脂质组分及其相对数量可控制Z终LNP大小（正如本文通过改变PEG-lipid量来展示；PEG-lipid优先存在于LNP外部并赋予稳定性，并通过进一步脂质单体结合抑制了后续生长）。

观察到采用微流体混合技术配制的LNP siRNA系统表现出接近100% 的siRNA 封装效率, 这表明随着介质极性增加, 具有阳离子脂类物质沉淀下来与siRNA核酸发生初期反应, 随后再经过进一步增加极性时被PEG-lipid包裹. 如前所描述, 这种模型符合低温透射电镜观测到 LNP siRNA 系统呈现“固态核心”电子密集外观, 与双层囊泡系统不同之处在于后者呈圆形结构且内部电子密度较低. 分子建模方法以及这些 LNP siRNA 系统所展现出来密度等物理特徵也支持了纳米结构脂数字核心存在.

值得注意的是，像SHM混合器这样的在线混合技术要求脂质在所使用的有机溶剂中可溶。在乙醇中溶解性较差的脂质可能需要加热溶剂以达到足够的溶解度，或者可以采用其他水相容性有机溶剂。SHM等微流体混合器可以由多种对大多数溶剂具有耐受性的材料构建。

与之前使用宏观混合技术（如PFV方法和T管混合技术）进行LNP siRNA合成相比，微流体配方过程具有几个优势。通过微流控工艺制备LNP siRNA系统能够实现更高的封装效率、生产更小型号的LNP系统，并且能够以小规模批量生产而几乎没有损失（设备死体积约为1 µl）。此外，不需要生产PFVs。

与T管混合器相比，微流控方法还包括以下优势：能够生产直径小于50纳米（T管法报道Z小直径为50纳米）的更小型号系统，并且使用低于1 ml/秒以上的高流速来实现快速混合并非必需。而微型搅拌器允许在明确定义、可重复条件下以较低流速进行LNP siRNA配方，在此情况下由于死体积少和简单地准备了用于LNP优化和离体测试等小规模批次而导致损失很少。

通过将微流控搅拌设备并行化，从台式试验制备转向大规模LNP siRNA制造也是一个主要优势。

总之，在本文呈现结果表明利用SHM微型搅拌器进行微流控搅拌使得20-100 纳米范围内 LNP siRNA 系统常规生产成为可能，并且提供易设计、低聚分散度、高siRNA封装效率、改进可伸缩性及与先前工艺相当甚至更好基因沉默效力等诸多优点。形成直径为 50 纳米或更小 LNP 的能力十分重要, 因为这类系统展示出穿透靶组织(例如肿瘤) 能力增强；同时，在三倍以上低比例下形成 LNP 系统亦显著促进了理想规模上 LNP 生产. 预计采用 SHM 进行 微 流 控 混 合 将 成 为 实 验 室 和 临 床 规 模 下 的 LN P 合 成 技 术 。

图1. 采用交错人字形微混合器(SHM)的脂质纳米颗粒(LNP)小干扰RNA(siRNA)制剂策略示意图。(a)乙醇中的脂质和水溶液中的siRNA通过注射泵被泵入微流体混合装置的两个入口。人字形结构诱导层流的混沌平流，导致乙醇和水相的快速混合，并相应地使脂质溶液的极性迅速增加。在临界极性下沉淀形成LNP。(b)微流体混合器的并行化，以便在保持相同生产条件的同时实现制剂规模化。这是通过垂直(i = 1, 2，..)和水平(j = 1, 2，...) 的混合器复制实现的，通过芯片上的管道进行流体处理。混合通道的尺寸为200 μm × 79 μm，人字形结构为31 μm高和50 μm厚。

图2. 交错人字形微混合器(SHM)的总流量较高降低脂质纳米颗粒(LNP)小干扰RNA(siRNA)的多分散性。多分散性指数(PDI)分别依赖于总流量和乙醇和水相中脂质和siRNA的浓度。PDI由动态光散射(DLS)提供的累积分析中的二阶系数确定(PDI = (σ/μ)2)。总流量从0.02到4 ml/min，保持水缓冲液与乙醇体积流量比在3:1恒定。水siRNA浓度从0.25到0.59 mg/ml，而脂质浓度从~4到10 mg/ml，保持siRNA/总脂质比在0.06 wt/wt恒定。PDI值代表4次测量的平均值。所采用的脂质成分为DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA，摩尔比为40:11.5:47.5:1.水缓冲液为25 mmol/l醋酸盐，pH 4.DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

图3. 增加PEG-c-DMA含量产生逐渐更小的脂质纳米颗粒(LNP)小干扰RNA(siRNA)系统。(a) 在快速混合条件下(4 ml/min总流量，siRNA缓冲液：脂质-乙醇体积流量比为3:1)产生的PEG-c-DMA含量对LNP大小的影响。LNP由DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，摩尔比分别为40:11.5:47.5:1, 40:11.5:46:2.5，和40:11.5:43.5:5,PEG-c-DMA分别为1,2.5，和5 mol%。LNP的siRNA-总脂质比为0.06 wt/wt。(b) 随着LNP大小从42 nm降至26 nm，通过增加PEG-c-DMA含量从1 mol%到5 mol%，封装效率。在测量封装前，LNP样品在磷酸盐缓冲液(PBS)中透析。封装是指使用阴离子交换自旋柱去除游离siRNA后，LNP中存在的siRNA百分比。(c) 随着LNP大小从54 nm降至28 nm，通过增加PEG-c-DMA含量从1 mol%到5 mol%，LNP的多分散性。如图2图例所述，确定了多分散指数(PDI)。(d)空LNP的大小作为PEG脂质含量的函数，其范围为0.25-5 mol%。LNP由DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，DLinKC2-DMA和DSPC分别保持在40和11.5 mol%。PEG-c-DMA的滴定通过调整胆固醇来补偿。所有LNP均在脂质-乙醇相中以初始脂质浓度20 mmol/l生产，然后与pH 4的25 mmol/l乙酸缓冲液混合。数字加权平均直径显示了对PBS透析后LNP的平均直径，以去除残留的乙醇，并将pH值提高到7.4。误差柱表示平均值的标准差(n = 3)。DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

图4. 脂质纳米颗粒(LNP)小干扰RNA(siRNA)的配方采用微流控混合，在广泛的siRNA-阳离子电荷比范围内高效封装。LNP由Dlin-KC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，摩尔比为40:11.5:47.5:1,siRNA-总脂质比为0.06 wt/wt。总流速维持在2 ml/min，使用10 mmol/l的脂质-乙醇相混合含有siRNA的水缓冲液(25 mmol/l醋酸盐，pH 4)。封装是指使用阴离子交换自旋柱去除游离siRNA后，LNP中siRNA的百分比。误差条表示从三个LNP配方测量的封装标准偏差。DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

图5. 含1和5 mol% PEG-c-DMA的脂质纳米颗粒(LNP)小干扰RNA(siRNA)系统的冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)显微图。(a)由DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA(摩尔比40:11.5:47.5:1)和siRNA组成的LNP siRNA的cryo-TEM显微图(wt/wt)。(b)由DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA(摩尔比40:11.5:43.5:5)和siRNA组成的LNP siRNA的cryo-TEM显微图(wt/wt)。LNP在50K放大率下成像。LNP配方在快速混合条件下(4 ml/min总流量，siRNA缓冲液：脂质-乙醇体积流量比为3:1)用交错人字形微搅拌器(SHM)进行，乙醇相含有30 mmol/l脂质。成像前浓缩LNP siRNA分散体。刻度条代表100 nm。DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

图6. 脂质纳米颗粒(LNP)小干扰RNA(siRNA)基因沉默效能的优化，作为阳离子脂质含量和siRNA/总脂质比的函数，在FVII小鼠模型中。(a) LNP DLinKC2-DMA含量对FVII小鼠模型中FVII基因沉默的影响。在静脉注射含有40到60 mol% DLinKC2-DMA的LNP siRNA系统24小时后，监测FVII表达。PEG-c-DMA含量保持在1 mol%，阳离子脂质的添加通过降低DSPC和胆固醇含量来补偿，保持DSPC与胆固醇的比值保持在0.25(mol/mol)。(b) siRNA/总脂质比变化对FVII小鼠模型中FVII基因沉默的影响。所使用的脂质成分为DLinKC2-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA(摩尔比60:7.5:31.5:1)。siRNA/总脂质比从0.01到0.35(wt/wt)变化，分别对应于siRNA与阳离子脂质荷电比为0.025、0.25、0.5和1。通过尾静脉注射向小鼠系统性给药LNP siRNA(n = 3/剂量水平)。注射后24小时收集血液，用比色法测定因子VII水平。

参考文献：
Nathan M Belliveau , Jens Huft , Paulo JC Lin , etal. Nucleic Acids ( IF 8.8 ) Pub Date : 2016-12-14 , DOI: 10.1038/mtna.2012.28.