错人字形混合器芯片制备空间稳定的脂质体：脂质组分和PEG脂质

由于微流控过程的可重复性、连续性和可扩展性，脂质药物递送系统的微流控制备越来越受欢迎。尽管该领域取得了令人兴奋的发展，但由于缺乏制备临床相关的空间稳定脂质体，微流控的多功能性和优越性仍需要进一步的证据。本研究描述了使用交错人字形混合器芯片(SHM)优化不同刚度的PEG脂质体配方。研究和讨论了过程参数(总流量(TFR)和水与乙醇流量比(FRR))和配方参数(脂质组分和组成、初始脂质浓度和水介质)的影响。脂质体配方包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)或1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)，成功制备了含有胆固醇和PEG化脂质(DSPE-PEG2000)的脂质体配方，具有理想的尺寸(∼100 nm)和分散性(<0.2)。通过pH梯度远程负载法，成功将阿霉素以高(>80%)的封装效率封装在这些脂质体中，说明了其作为药物递送系统的双层完整性和能力。我们证明了临床相关的聚乙二醇化脂质体配方可以制备出与传统技术相当的性能。我们还讨论了聚乙二醇化脂质体微流控生产的局限性和建议。

脂质体是封闭的磷脂囊泡，已被临床批准用于封装各种治疗和诊断。微流控技术已经被探索用于以良好控制、可重复和高通量的方式制备脂质体，从而克服了传统技术的障碍，即批次间重复性低和通量有限。最近一个令人兴奋的进展是交错人字形微混合器(SHM)的发展，与传统的微流体水动力聚焦(MHF)器件相比，它表现出良好的优越性(更高的通量，更快的混合和更小的稀释)。

目前，有两个障碍阻碍了微流控技术作为传统技术的优选技术的发展：没有先前微流控知识和经验的研究人员在设计、选择和操作微流控设备方面的障碍；以及对微流控技术是否能够满足其特定需求的担忧，因为传统方法已经能够提供。前者已经通过微流控设备的商业化而得到缓解，而后者可以通过证明微流控技术在制备临床相关的脂质体配方方面与传统方法相比的功能性来解决。

迄今为止，大多数临床批准(和临床试验)的脂质体配方是空间稳定的，直径为100-150 nm。与非PEG化脂质体相比，PEG化脂质体显示出更高的稳定性、更低的分散性和更长的血液循环时间。PEG化在临床上的重要性已经通过将PEG脂质体纳入临床批准的脂质体配方：Doxil®和Onivyde®得到证明。尽管对空间稳定的药物递送系统有很高的需求，但大多数现有的微流体研究(不限于SHM)报告了非PEG化配方的生产。很少有研究报告了PEG化脂质体的制备，这些脂质体要么尺寸很小(约50 nm)，要么不稳定，要么分散性高(>0.2)。例如，Zhigaltsev等人未能使用SHM微流体生产稳定、均匀、高相变脂质体(DPPC或HSPC)，并需要与不饱和脂质混合以增强这些PEG化脂质体的稳定性。此外，这些报告中的大多数只研究了总流速(TFR)和水乙醇流速比(FRR)对脂质体质量的影响，因为它们是脂质体合成的一个工艺参数。这种方法可能已经证明了微流控技术的鲁棒性和简单性，其中纳米颗粒的优化可以通过简单地控制TFR和FRR来实现。另一方面，这可能表明我们对这种技术制备脂质体的局限性缺乏知识。即，仅通过优化加工参数，无法制备出具有最佳尺寸和分散性的配方。

到目前为止，这里已经有少数研究报告单独的配方参数的影响：选择水和/或有机介质；脂质浓度；脂质组分和组成对纳米颗粒的制备。然而，关于一些参数的影响有矛盾的结果，可能由于微流控设备和调查值范围的差异，导致难以做出结论性的比较。令人鼓舞的是，Forbes等人最近的研究使用SHM研究了制备温度、脂质浓度、脂质组分和组成对非PEG化脂质体的脂质体大小和分散性的影响。在这里，我们已经成功地证明了使用SHM制备的PEG化脂质体配方具有理想的尺寸(约100 nm)和分散性(<0.2)。我们系统地研究了配方参数(水介质、初始脂质浓度、脂质组分和组成)的影响，以及加工参数(TFR和FRR)。据我们所知，这是第一个使用SHM生产稳定、均匀(约100 nm)的PEG化脂质体的报告，包括液体和固体脂质体配方，其中后者更具临床意义。

微流控制备脂质方法
采用交错人字形微混合器（SHM）作为微流控装置制备脂质体。脂质体溶解于乙醇中，制备适当浓度和摩尔比的脂质混合物。制备脂质体的水溶液包括去离子水(DW)、等渗生理盐水(NS;0.9% w/v NaCl)、磷酸盐缓冲盐水(PBS;10 mM磷酸盐，0.8% w/v NaCl,pH 7.4)、HEPES缓冲盐水(HBS;20 mM HEPES,0.8% w/v NaCl,pH 7.4)和硫酸铵((NH4)2SO4;240 mM,pH 5.4)。所有水溶液均通过0.22 μm聚醚砜注射器过滤器，然后注入SHM。

脂质混合物的乙醇溶液和水介质被注入到SHM中，其体积流速由两个注射泵控制。实验设置如图1所示。对于由高熔点磷脂(DPPC和DSPC)组成的配方，使用加热带来保持乙醇和水溶液的温度至少高于磷脂的凝胶到液态晶体相变温度10°C(DPPC为51°C,DSPC为65°C)。从SHM的出口收集脂质体，在室温下隔夜透析去除乙醇，对1 L用于制备的相同水介质，在不断搅拌下，使用Pur-A-LyzerTM透析试剂盒。

表1：脂质配方的组成

图1. 水介质对DOPC5大小和分散性的影响。在DW、NS和PBS中制备的10mM DOPC5的Z平均直径和分散性，TFR为1和2 mL/min,FRR为1。实线和虚线(〇)分别表示脂质体Z平均直径和分散性。数据代表至少三个独立实验的平均值±SD。与相同TFR的DW相比，所有均值之间的差异均以p < 0.05表示(LSD检验)。**，p < 0.01比较Z平均直径。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p < 0.001比较分散性。

图2.TFR和FRR对DOPC5大小和分散性的影响。在(a)NS和(b)PBS中制备的10mM DOPC5的Z-平均直径和分散性，TFR为1和2 mL/min,FRR为1、2、3和5。实线和虚线(〇)分别表示脂质体Z-平均直径和分散性。数据代表至少三个独立实验的平均值±SD。所有均值之间的差异，p < 0.05表示(t检验)，比较TFR与相同的FRR。*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001比较Z-平均直径。

图3. 初始脂质浓度对DOPC5大小和分散性的影响。在NS和PBS中制备的5、10、15mM的DOPC5的Z平均直径和分散性，TFR为2 mL/min,FRR为1。实线和虚线(〇)分别表示脂质体Z平均直径和分散性。数据代表至少三个独立实验的平均值±SD。与10 mM相比，所有p < 0.05的均值差异均被标记(LSD检验)。#，p < 0.05；##，p < 0.01比较分散性。

图4. FRR对DSPC5大小和分散性的影响。在NS或PBS中制备的10mM DSPC5的Z-平均直径和分散性，TFR为2 mL/min,FRR为2、2.5、3和4。实线和虚线(〇)分别表示脂质体Z-平均直径和分散性。数据代表至少三个独立实验的平均值±SD。

图6. 磷脂刚性对脂质体大小和分散性的影响。在NS和PBS中制备的10mM DOPC5、DPPC5和DSPC5的Z平均直径和分散性，TFR为2 mL/min,FRR为3。实线和虚线(〇)分别表示脂质体Z平均直径和分散性。数据代表至少三个独立实验的平均值±SD。所有均值之间的差异，在相同的水介质中比较DSPC5,p < 0.05被标记(LSD检验)；*，p < 0.05；**，p < 0.01比较Z平均直径。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p < 0.001比较分散性。

表2：通过SHM装置在不同水介质(NS, PBS (pH 7.4)， HBS (pH 7.4)， and (NH4)2SO4 (pH 5.4))中制备的用于稳定性研究的空间稳定脂质体配方的优化流动条件，相应的流体动力直径和分散性(初始脂质浓度为10 mM)。数据代表至少三个独立实验的平均值±SD。

图7. 微流控制备脂质体的结构阐释。(a)DOPC5，(b)DSPC2.5，和(c)DPPC5的透射电子显微镜(TEM)图像，它们各自的最佳流条件，如表2中所述。制备的脂质体具有直径约100纳米的水泡结构。比例尺为(a)200纳米，(b,c)100纳米。

我们系统地调查了所有可能影响空间稳定脂质体生产的因素。在此，我们提出了一个通用流程图，作为定性建议，用于使用SHM微流控设计和优化空间稳定脂质体配方(图2)。 该流程图是基于每个参数对所制备脂质体的影响而安排的，并总结了改变加工和配方参数对所制备脂质体的大小和分散性的影响。我们已经表明，当我们用微流控优化配方时，我们希望按照向下的方向设计每个参数，并从加工参数开始优化每个参数。如果优化加工参数不能解决遇到的问题，我们必须按照向上的方向修改配方；在最坏的情况下，改变脂质组分。

我们的研究表明，通过控制加工和配方参数，所有三种PEG化配方都成功地制备了所需的尺寸(~100 nm)、分散性(< 0.2)和最终脂质浓度(7.5 mM)，与传统薄膜水合挤出法制备的配方相当。透射电镜证实了优化脂质体的囊泡结构。通过pH梯度将DOX远程装载到脂质体中进一步验证了其膜完整性和作为药物传递系统的能力。尽管DSPC5在分散性方面具有次优特性，但它也能保持pH梯度，并具有令人满意的DOX封装效率。此外，虽然不饱和DOPC5和饱和DPPC5配方可以通过改变加工参数(TFR和FRR)以相对简单的方式制备，但无论加工参数如何，DSPC5都是分散的(分散性> 0.2)。通过优化配方参数，即DSPE-PEG2000的含量，制备了直径小、分散性低的改良DSPC2.5配方。

参考文献：
Cheung CCL, Al-Jamal WT. Int J Pharm. 2019 Jul 20;566:687-696.