阳离子胆固醇依赖性LNP向肺干细胞、肝脏和心脏的递送

在脂质纳米颗粒(LNP)中添加阳离子辅助脂质可增加肺递送并减少肝递送。然而，目前尚不清楚电荷依赖性趋向性是否是普遍存在的，或者是否取决于带电组分。本文报道了阳离子胆固醇依赖性趋向性可能不同于阳离子辅助脂质依赖性趋向性的证据。通过测试196个LNP如何向22种细胞类型递送mRNA，我们发现带电胆固醇与带电辅助脂质相比导致了不同的肺：肝递送比。我们还发现，将阳离子胆固醇与阳离子辅助脂质结合后，在心脏以及几种肺细胞类型(包括干细胞样群体)中导致了mRNA递送。这些数据突出了探索电荷依赖性LNP趋向性的实用性。

脂质纳米颗粒(LNPs)在静脉注射后可将RNA治疗传递至患者肝细胞。因此，人们对非肝组织的递送产生了兴趣，这通常通过三种方法实现。第一种方法是抑制LNPs的摄取或肝脏中治疗有效载荷的后续活性。第二种方法是将活性靶向配体(包括抗体或小分子)添加到LNPs上，使其从肝细胞中重定向。Z后，第三种方法是修改LNP的化学成分，从而使内源性运输远离肝细胞。这可以通过设计可电离脂质或添加带电荷的辅助脂质来实现，这可以增加非肝：肝向性。在一个例子中，科学家们发现，通过分别添加正电荷或负电荷，RNA-脂质复合物被靶向肺或淋巴组织。在另一个例子中，用阳离子辅助脂质1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)取代两性离子磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，将LNPs从肝脏重定向到肺。随后，其他观察结果也被报道，包括含有第五种阳离子组分的LNPs可以被重新定向到肺。考虑到在添加阳离子辅助脂质后增加肺：肝输送的一致性，一个合理的假设是电荷依赖性趋向是普遍存在的，因此任何正电荷组分都应该增加肺输送而减少肝输送。然而，其他观察结果表明LNP趋向可能是复杂的，包括胆固醇结构可以通过影响内吞作用来影响输送的数据。综上所述，这些数据使我们假设带电荷的胆固醇对非肝脏输送的影响可能与带电荷的辅助脂质不同。

用带电荷的辅助脂质配制的LNPs通常会增加肺部输送，减少肝脏输送，这表明电荷可能是向性的一个驱动因素。在这里，我们报告了阳离子依赖性向性的证据，可能取决于带电的组分。虽然我们的数据表明，在未来的LNP配方中应该考虑阳离子胆固醇，但这项研究也存在一些局限性。首先，我们的研究结果是在小鼠中进行的；解剖、生理或遗传差异可能会使非人类灵长类动物的输送不同。其次，我们尚未调查LNP+0相对于LNP0+观察到的向性变化背后的潜在生物学机制。我们计划探索的三个机制是血清蛋白吸附、与内吞作用受体的相互作用以及细胞的内吞后转化加工。第三，虽然我们使用了许多LNPs进行观察，但它们都是用cKK-E12配制的。因此，了解这种观察是否与许多其他可电离脂质一起进行是很重要的。Z后，LNP++导致小鼠在早期时间点的一些细胞因子升高。因此，有必要对小动物的LNP治疗窗进行表征，并确定这是否足以用于较大物种的研究。

单细胞文库制备。
 使用BD Rhapsody单细胞分析系统(BD Biosciences)对整个肺和心脏细胞进行全转录组分析。使用EasySepTM死亡细胞(Annexin V)和RBC(抗TER119)去除来消除死细胞和红细胞。每个样本在继续进行之前，用独特的抗小鼠标签抗体孵育，并用RoboSep缓冲液洗涤。对于汇集样本，一个BD Rhapsody盒装载了40,000个细胞。然后装载条形码珠子，并裂解细胞。从捕获的mRNA和样本标签上，使用BD Rhapsody全转录组分析(WTA)扩增试剂盒根据BD Rhapsody系统mRNA WTA和样本标签文库制备协议(BD Biosciences)制备cDNA文库。使用量子比特荧光计对Z终文库进行定量，并使用ExperionTM自动电泳系统(Bio-Rad)测量大小分布。

使用zUMIs进行RNA映射和计数，Salmon Alevin进行细胞散列。所有样本都映射到GRCm39，外显子区域被计数。输出文件被加载到Seurat中。细胞对数标准化为10000的比例因子，然后使用线性变换进行比例缩放。使用DoubletFinder识别双重。随后，进行PCA和t-SNE分析，并将结果导出到BBrowser2中进行分析。使用细胞搜索工具识别每个簇内的细胞类型，并在簇上覆盖tdTomato表达。

我们基于光场成像流式细胞仪进行了图像采集。该装置由HR-FLFM、基于微流体的样品传输系统和频闪多色激光照明系统组成。我们在Eclipse Ti2-U显微镜上构建了HR-FLFM，该显微镜配备Plan Apo Lambda 100x 1.45 NA Oil物镜(尼康)。使用定制的微透镜阵列(RPC Photonics)在傅里叶域中划分光场。HR-FLFM图像由ORCA-Flash 4.0 V3数字CMOS相机(滨松光电)捕获。样品通过三通道微流体流量控制器和传感器系统(Elveflow)通过微流体芯片传输。我们应用频闪照明方案来减少运动模糊，并以200 Hz的帧速率获取图像。相机曝光时间设置为5 ms，而频闪照明的有效曝光时间为100 μs。

对采集的图像进行阈值滤波，以去除视野中没有成像目标的空白帧。对于多色成像，根据亚细胞结构的荧光信号选择相邻帧并将其分组。然后对分组后的图像进行滚动球背景减除和ACsN去噪算法，以提高图像信噪比。然后，在进行三维重建之前，应用圆形掩模来突出每个元素图像。在重建过程中，我们使用Titan RTX显卡(Nvidia)来加速Richardson-Lucy反卷积过程。我们使用大约50次迭代来实现每个三维体积的高分辨率亚细胞成像。

我们通过量化196个LNP在体内将mRNA递送至5个组织的22种细胞类型的方式来测试这一假设。我们进行了4个实验，每个实验测试一个带有给定电荷的文库。一个文库作为肺递送的阴性对照，包含含有中性胆固醇和中性辅助脂质的LNP，因此命名为(00)。其他三个文库包含中性胆固醇和阳离子辅助脂质(0+)，据报道可增加肺递送并减少肝递送；阳离子胆固醇和中性辅助脂质(+0)；或阳离子胆固醇和阳离子辅助脂质(++)。为了确保递送中的任何差异是由胆固醇或辅助脂质电荷驱动的，我们在所有四个文库中使用了经过验证的可离子化脂质cKK-E12(24)和聚乙二醇-脂质(PEG-脂质)C14PEG2000。为了控制摩尔比依赖效应，我们使用8种比例配制每个LNP。这导致了216个化学上不同的LNPs(图1A和B)。 在使用微流体设备配制LNPs后，我们使用动态光散射(DLS)检查了化学成分和水动力直径之间的关系。我们发现，使用中性胆固醇和阳离子辅助脂质配制的LNPs形成的颗粒在统计上比其他组大； 需要注意的是，每组的颗粒数量非常大(图1C)。 我们没有观察到水动力直径和胆固醇或辅助脂质摩尔比之间有统计学意义的关系(图1D和E)。 在所有四个库中，超过85%的LNPs的水动力直径小于200 nm，并且具有单分散的DLS光谱，在4°C下储存3周后，库的水动力直径是一致的(SI附录，图S3B)。 Z后，我们使用透射电子显微镜(TEM)对所有四个库进行了成像，并再次发现了小的、稳定的LNPs(SI附录，图S3C)。 这些生物物理数据使我们得出结论，改变不同组分的电荷不会实质上改变LNP结构。

图1 四个含有不同胆固醇或辅助脂质荷载的LNPs的文库形成了小而稳定的LNPs。(A和B)LNPs在四个组分的八种不同摩尔比下通过改变九种辅助脂质和三种胆固醇配制而成，总共产生216个LNPs。(C)每个文库中的LNPs(灰色)形成小(50至200 nm)LNPs，池直径(紫色)在每个文库的LNPs池范围内，表明没有LNP聚集。0+文库由直径明显较大的LNPs组成。报告的直径包括所有八种测试的摩尔比。单因素方差分析，每个文库的平均直径与每个其他文库的平均直径相比较，***P < 0.0003。四个文库合并报告的LNP直径与(D)胆固醇摩尔比和(E)辅助脂质摩尔比无关，均值±标准差。

图2 阳离子胆固醇进入LNPs调节体内mRNA的全身递送。(A)每个LNP库由携带Cre mRNA和DNA条形码的LNPs组成，通过尾静脉注射给Ai14小鼠。注射后3至4天，分离5个器官，在22种细胞类型中定量tdTomato表达。使用FACS对tdTomato+细胞类型进行分类。从分类的tdTomato+细胞类型中提取条形码，并使用NGS进行测序。NGS在细胞类型水平上定量LNP体内递送。(B)每个库中所有细胞类型的LNP标准化递送。未被封装在LNPs中的裸条形码被发现少于LNPs携带的条形码。标准化递送通过两步过程计算。首先，感兴趣的细胞类型中每个条形码的计数除以同一细胞类型中所有条形码的总计数。第二，条形码计数标准化为LNP输入样本(注射到小鼠的LNP池)。(C)含有阳离子胆固醇的LNPs比含有阳离子辅助脂质的LNPs显示出较低的肺：肝mRNA递送。由阳离子胆固醇和阳离子辅助脂质组成的LNPs改善了非肝：肝mRNA的传递。单因素方差分析，****P < 0.0001，***P = 0.0007，**P < 0.006，*P < 0.04，平均值±标准差。(D)(+ 0)文库靶向所有肝细胞类型，而非(0)。非配对t检验，****P < 0.0001，***P = 0.0005，**P = 0.006，平均值±标准差。

图3 正电荷位置影响体内非肝脏：肝脏mRNA的全身递送。(A)来自(0+)和(+0)筛选的性能Z佳的LNPs携带相同的四种成分摩尔比。(B)这些LNPs形成小而单分散颗粒，携带类似的正电荷。(C)LNP+0在所有细胞类型的肝脏递送中胜过LNP0+。mRNA递送也在(D)肺、(E)肾、(F)心脏和(G)脾中进行了量化。(D-F)LNP+0和LNP0+导致了向肺内皮细胞、肺免疫细胞、肾免疫细胞和心脏内皮细胞的显著差异mRNA递送。未配对t检验，****P < 0.0001，***P = 0.0009，**P < 0.0095，*P < 0.045，平均±SD。

图4 LNP++将mRNA传递到心脏EC以及肺细胞类型。(A)LNP++由DC-胆固醇和DOTAP组成，分别作为阳离子胆固醇和阳离子辅助脂质组分。(B和C)LNP++改善了肺：肝mRNA传递，并导致显著的心脏EC传递。平均±SD。(D)LNP++靶向肺和心脏，在单细胞水平上使用HR-FLFM成像。(E)肺、心脏和肝脏的RNAscope成像。图像上的标尺：50 μm。(F)从注射PBS或LNP++的小鼠分离的心脏细胞的t-SNE图示。(G)tdTomato mRNA表达重叠在心脏细胞上。通过单链RNA-seq在单细胞水平上证实，LNP++主要将mRNA传递到心脏EC。

图5 LNP++介导全身性肺上皮和干细胞mRNA传递。(A) 以1.5 mg/kg剂量将携带aVHH mRNA的LNP++注射到BL/6小鼠体内。注射后一天，在肺、心脏、肾脏、肝脏中测定aVHH表达。(B) 探索了向肺非EC细胞类型(通过血管物理上较难进入)传递mRNA。(C) LNP++导致mRNA传递到上皮细胞、干细胞和免疫细胞。非配对t检验，****P < 0.0001，***P = 0.0005，*P < 0.048，平均±SD。

参考文献：
Radmand A, Kim H, Beyersdorf J, Dobrowolski CN, Zenhausern R, Paunovska K, Huayamares SG, Hua X, Han K, Loughrey D, Hatit MZC, Del Cid A, Ni H, Shajii A, Li A, Muralidharan A, Peck HE, Tiegreen KE, Jia S, Santangelo PJ, Dahlman JE. Cationic cholesterol-dependent LNP delivery to lung stem cells, the liver, and heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Mar 12;121(11):e2307801120. doi: 10.1073/pnas.2307801120.