多肽常识

肽的纯度、含量、总重与实际重量

根据总重和HPLC分析的纯度，样品中目的肽的含量是如何确定的呢？我公司的多肽发货时是以总 重来计算的，也就是肽冻干后的实际重量，其中包括在冻干过程中，其它杂质如残留的水分、来自带相 反电荷离子的盐分等的重量。 肽的纯度是指在波长214nm时样品中目的肽所占的比例，样品中可能含有缺失序列、短片段、脱保 护不完全的序列等等。肽的纯度是在肽的Zda吸收峰214nm处由HPLC分析而得到的，肽中一般还含有 水分和盐分，但肽的纯度没有把它们计算在内。 肽的含量是指所有肽在样品中所占的百分比，样品中包含所有的肽及水分、盐分等，肽的含量通过 氨基酸分析得到。 目的肽的含量是指在样品中目的肽的纯度与其含量的乘积。

肽的溶解性

以我们的经验，溶解肽是一个很重要的环节。如果溶解不当可能导致肽损失或者实验失败。肽的溶 解性主要取决于肽的序列，所以，如果实验允许，肽序列中至少应包含20%的带电残基以增加其溶解度。 在使用之前，客户可以遵循以下三个基本原则来选择合适的溶剂溶解多肽。首先，所选溶剂一定能 充分溶解多肽；其次，所选溶剂能与实验条件兼容；Z后，所选溶剂不能与肽反应，也不能使肽降解。只 要肽的量允许，可以先用少部分肽溶解，然后再将全部样品溶解。如果需要从溶剂中回收肽，可以选择 一种初始溶剂使其在冻干后容易去除。 以下建议或许对您溶解肽有所帮助： 1. 少于5个氨基酸的肽一般溶于水溶液，强疏水的氨基酸（W，I，L，F，M，V，Y）除外。 2. 如果带电氨基酸平均分布于全部序列中，那么含有>25%带电氨基酸（E，D，K，R，H）的亲水肽 和含有<25%疏水氨基酸的肽一般都能溶于水溶液。多肽的纯化系统一般为0.1%TFA/水和0.1%TFA/ ACN。因此，如果肽溶解在没有缓冲能力或者缓冲能力很弱的缓冲液中，结果可能导致肽溶液呈酸 性。在使用别的方法溶解肽时务必使溶剂的pH值近乎中性。酸性肽（E+D残基数多于K+R+H残基 数）和碱性肽（K+R+H残基数多于E+D残基数）在中性pH值条件下比在酸性pH值下更易于溶解。 3. 对于疏水氨基酸含量为50%～75%的肽，即使序列中含有>25%带电氨基酸也有可能不溶于水或者 部分溶解。best先把肽溶于Z少量的强有机溶剂如DMF、ACN、异丙醇、乙醇、乙酸、4-8M GdnHCl、 尿素，或者DMSO（序列中没有C，W，M时），及其它类似的有机溶剂中。best将溶解肽的有机溶 剂缓慢地逐滴加入水溶液中，如果溶液变浑浊，可能是达到了溶解极限，继续溶解就没什么用了。 需要注意的是，Z开始选择的溶剂应该与实验系统兼容。 4. 疏水氨基酸含量>75%的强疏水肽一般也不溶于水溶液。此类肽也应该先用强有机溶剂（如TFA，甲 酸）溶解，如果将其加入到水溶液中也可能产生沉淀。Z后的肽溶液可能需要高浓度的有机溶剂使 之变性，而有机溶剂一般不用于活细胞的生物功能研究。 5. S，T，E，D，K，R，H，N，Q，Y含量高（>75%）的多肽序列容易形成多余的分子间氢键网络， 在浓的水溶液中容易形成凝胶。此类肽可以用步骤3所述方法溶解。 为了减少溶解中可能出现的问题，建议客户从设计上和序列上多加考虑，以改善肽的溶解度。

肽的溶解方法

用哪种溶剂溶解合成肽一直是困扰多肽工作者的一个难题。根据不同的氨基酸序列，可以参考以下 方法来溶解合成肽。best是先将少量肽用水溶液溶解，不要一次将全部样品都溶解掉。 1. 将酸性氨基酸Asp (D)，Glu (E)和C端-COOH的值定为-1。 2. 将碱性氨基酸Arg (R)，Lys (K)，His (H)的值定为+1。 3. 计算肽中全部电荷量。 4. 如果肽的全部电荷为正值，则肽呈碱性，可以先用水溶解。如果肽不溶于水，可以用10%乙酸或者 更高浓度的乙酸溶解。如果肽一点都不溶，加入TFA(<50ml)助溶，并用去离子水稀释至1ml。 5. 如果肽的全部电荷为负值，则肽呈酸性，可以先用水溶解。如果肽不溶于水，加入NH4OH(<50ml) 助溶，并用去离子水稀释至1ml。 6. 如果肽的全部电荷为0，则肽呈中性。中性肽需要用乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂来溶解，也可 以加入变性剂（如尿素、盐酸胍等）。　

实例：　　　　KRLMKSIEVIMPL: (+4) + (-2) = +2。此条肽呈碱性。见以上步骤4。

　　　　　　　LVKMKSIEDPDCE: (+3) + (-5) = -2。此条肽呈酸性。见以上步骤5。

　　　　　　　MVSRKDLVEHRDM: (+4) + (-4) = 0。此条肽呈中性。见以上步骤6。

肽的贮存

贮存时间太长的多肽样品可能出现一些问题。冻干多肽通常稳定性较好，一般来讲冻干多肽在-10℃ 或更低温度条件下能贮存几年而不会降解。但如果以溶液状态保存，其稳定性就会受到影响。由于多肽会被微生物、细菌和蛋白酶降解，因此best用无菌溶液溶解多肽，可以用无菌水、蒸馏水溶解，或者溶 解后过滤CJ。对于那些含有Met、Cys、Trp的肽，由于氧化作用会产生其它杂质或使其丧失生物学活 性，因此，含有上述氨基酸的肽应该用无氧溶剂溶解。 关于溶剂的pH，多数肽在酸性条件下比较稳定。建议溶剂的pH范围为3～6，溶解的多肽best分装 后冷冻保存，避免反复冻融。为保持肽的稳定性，建议多肽best以冻干粉状态保存。

常见问题及参考意见

Q：国肽生物对本公司的产品是如何监控的？

A ：所有合成肽都经过HPLC和MS分析，除MALDIMS 外，由于肽在不同的质谱仪中，能按其本身 的序列进行离子化，我们可以运用HPLC-MS技 术对HPLC中那些离子化的峰进行分析。我公司 的技术装备[MALDI-MS，HPLC-(ESI)MS（离 子阱和四极管阵列）]为分析提供可靠的保证。

Q：请介绍一下你们的纯化策略

A：我公司合成的多肽是用制备型反相HPLC进行 纯化的，所用的两种流动相中都添加了TFA，pH 2。A相是0.1% TFA于超纯水中，B相是0.1% TFA 于ACN 中，pH 2。样品可以直接用A相 溶，或者先用少量B相溶解再用A相稀释。有 时可能需要用强溶剂如甲酸、乙酸来溶解疏水 肽，具体采用哪种方法要看肽序列。在pH 6.8 时一般很难将肽溶解也很难进行纯化，因此我 们一般是先将肽溶解再用两种流动相进行梯度 洗脱。所用的pH 6.8的缓冲液为10 mM醋酸铵 于超纯水中（流动相A），纯ACN（流动相B）。 通过紫外检测器在214 nm处检测，收集不同组 分并用MADLI-TOF MS进行成分鉴定，用反相 HPLC分析纯度，然后把目的肽冻干，将冻干的 肽合并装入小瓶中，Z后，再对合并后的产物进 行MS和HPLC分析。

Q：如何解释MALDI(MS)中的P+Na 和P+K峰？

A：经常会在MALDI中看到Na峰和K峰，钠和钾 来源于溶剂水。即便是蒸馏水和去离子水也会 含有痕量的钠离子和钾离子，无法完全除去。它 们在进行质谱分析时也会离子化并与肽的自由 羧基结合。因为没有纯化水的系统将水中的钠 离子和钾离子除去，所以有时候在MALDI MS 图谱中出现钠峰和钾峰也是再所难免的。

Q：合成肽在长度上有何限制？

A：我公司合成的多肽长度为6～50个氨基酸。标 准的固相合成程序一般能合成6～50个氨基酸 的多肽。

Q：肽的纯度能达到多少？我的实验需要多少纯度？

A：我公司可以提供不同的纯度级别供客户选择， 从粗品到>98%纯度。根据客户需要我们可以提 供纯度>98%的超纯多肽。各种纯度及应用范围 如下： >70%，用于免疫实验和不敏感的筛选实验 >80%，用于免疫实验和不敏感的筛选实验 >90%，用于SAR研究和生物检测 >95%，用于NMR，晶体结构研究及生物检测 >98%，用于NMR，晶体结构研究及敏感的生物 检测

Q：什么是净重？什么是肽含量？

A：肽冻干后一般呈现为蓬松的绒毛状，由于肽本身 的特性决定了其中可能仍然含有痕量的水分、吸 附的溶剂及盐分等。这不代表肽的纯度不够，仅 仅是影响肽的实际含量，使其降低了10%～30%。 肽的净重是指肽的实际重量减去水分和质子化离 子后的重量。为保证肽的浓度，需要从粗品肽中 把非肽物质去除。

Q：国肽生物如何运输多肽？都提供哪些检测报告？

A：所有冻干的多肽都盛放在2 ml或10ml的螺旋盖 小塑料管里，都附带有原始的分析数据和合成 报告单，上面包含有多肽的序列、分子量、纯 度、重量、编号等重要信息。

Q：什么样的保存条件是best的？多肽的稳定性怎 样？

A：多肽冻干后呈绒毛状或絮状粉末，可避免多肽 的过早降解。建议贮存条件为： a. -20℃贮存或者在干燥环境中贮存 b. 尽量避免反复冻融 c. 尽量避免以溶液状态贮存（为使用方便可以 将冻干粉分装后贮存） d. 如果必须以溶液状态贮存，建议用无菌水在 弱酸性条件下溶解多肽并于-20℃贮存.

Q：如何溶解多肽？

A：多肽的溶解度主要取决于其一级结构和二级结构，修饰标记的性质及溶剂类型和终浓度。如果 肽难溶于水，超声可以助溶。对于碱性肽，建议 用1 0 % 乙酸溶解；对于酸性肽，建议用 10%NH4HCO3溶解。不溶于水的多肽也可以添 加有机溶剂助溶。用Z少量的有机溶剂（如 DMSO、DMF、异丙醇、甲醇等）将肽溶解，强 烈推荐先将肽溶于有机溶剂中，然后缓慢加入 水或其它缓冲液直至所需浓度。

Q：国肽生物能合成哪些修饰标记的多肽？

A ：我公司提供多种修饰标记的多肽，如乙酰化、生 物素标记、磷酸化修饰、荧光修饰，也可以根据 您的特殊需要定制不同的修饰。

Q：哪种末端Z适合我的研究？

A：肽的末端默认为N端游离的氨基，C端游离的 羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列， 为了与母本蛋白更为接近，肽末端往往需要封 闭，即N端乙酰化，C端酰胺化，这种修饰避免 引入多余电荷，也使其更能防止外切酶作用，使 肽更加稳定。

Q：为什么要进行N端乙酰化，C端酰胺化修饰？

A：这些修饰可以使肽不会被降解掉，也可以使肽 模拟它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始状态。

Q：就磷酸化肽的设计能不能给出一些建议？

A：随着长度的增加，从磷酸化的那个氨基酸往后 偶联效率逐渐降低。合成方向从C端到N端，建 议磷酸化的那个氨基酸以后的残基不要超过10 个，也就是说从N端往C端数磷酸化氨基酸之 前的氨基酸残基best不要超过10个。

Q：如果想在N端做生物素修饰，需要在生物素 和肽序列之间加一个间隔吗？

A ：我公司采用的标准的生物素标记程序是先往肽 链上连一个Ahx，然后再连生物素。Ahx是一个 6碳化合物，把它加在肽和生物素之间起到间隔 的作用。

Q：是不是在肽和修饰标记的染料之间都需要加 一个间隔？

A：如果你打算将一个大分子（如某种染料）连到肽上，best在肽和配体之间设一个间隔，以尽量减 少肽本身的折叠作用或者其偶联物的折叠作用对受体造成的干扰。也有人不希望间隔的存在，例 如，在蛋白质的折叠研究中，可以通过确定将荧 光染料连在某个氨基酸的某个位点上来研究二者 在折叠结构上相距多远。

Q：我需要合一条环肽，其中含有一个色氨酸， 它会被氧化吗？

A：色氨酸的氧化是肽氧化中的常见现象，而肽一 般是先环化再纯化，如果其中的色氨酸发生了 氧化作用，肽在HPLC柱上的滞留时间会发生变 化，氧化可以通过纯化去除。再者，氧化的肽也 可以通过MS检测到。

Q：如何确定肽已成环？

A ：我们用Ellman反应来检测成环反应是否完全。 如果Ellman检测结果为阳性（黄色），说明成环 反应不完全；如果检测结果为阴性（不是黄色）， 说明成环反应已进行完全。我们对客户不提供 环化鉴定的分析报告，一般在QC报告单中会有 关于Ellman检测结果的描述。

Q：含有Cys的多肽在出货前经过还原了吗？

A ：如果没有发现肽已经被氧化，我们一般不对Cys 进行还原。所有的多肽都是由粗品在pH2条件 下纯化、冻干后得到的，这样的pH条件至少在 某种程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般 在pH2条件下进行纯化，除非有特殊原因需要 在pH6.8条件下纯化。如果纯化在pH6.8进行， 纯化产物必须马上用酸处理以防氧化。在Z后 的质量控制环节，对于含有Cys的肽，如果MS 图谱上发现有分子量为(2P+H)的物质存在，说 明已形成二聚体。如果MS和HPLC都没有问题， 我们就直接冻干后出货，无须再做任何处理。需 要指明的是，含有Cys的肽随着时间的推移会发 生缓慢的氧化，氧化程度主要取决于肽序列及 贮存条件。

国肽生物主要提供：多肽合成、多肽定制、同位素标记肽、人工胰岛素、磷酸肽、生物素标记肽、荧光标记肽（Cy3、Cy5、Fitc、AMC等）、目录肽、偶联蛋白（KLH、BSA、OVA等）、美容肽、化妆品肽、多肽文库构建、抗体服务、糖肽、订书肽、药物肽、RGD环肽等。

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