合成多肽及其应用

[摘要]本发明公开了一种合成多肽，包含：(a )所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示，( b)在( a )限定的合成多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a )所述多肽具有相同生物学功能的由( a )衍生的多肽，本发明合成多肽是根据已有的胆碱结合序列，结合Swiss-Model在线软件进行结构分析，设计的一种合成多肽，本发明是一种合成多肽，其具有与肺炎链球菌表面胆碱分子结合的特性，具有肺炎链球菌的YZ生长及促进自溶的能力 ,本发明无毒，具有一定的应用潜力。

1 .一种合成多肽，其特征在于，所述合成多肽包括：

(a)所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示；

(b)在(a)限定的合成多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多肽。

2 .如权利要求 1所述的合成多肽 ，其特征在于 ，所述合成多肽的 相对分子量为2367 .64g/mol。

3 .一种如权利要求1所述的合成多肽在制备抗肺炎链球菌生长和促溶药物中的应用。

4 .如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述合成多肽对肺炎链球菌生长的ZDYJ浓度是25μg/mL。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)属于厚壁菌门-链球菌科是一种革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界，常寄居在正常人鼻咽腔中。肺炎链球菌是一种条件致病菌，当宿主免疫力降低时就会发病。它是引起社区获得性肺炎、支气管炎、鼻窦炎、中耳炎、败血症以及脑膜炎等疾病的主要致病菌。新生儿及免疫力低下的人群为肺炎链球菌感染的高危人群 ,每年有超过100万名年龄小于5岁的儿童死于肺炎链球菌的相关侵袭性疾病。

肺炎练球菌具有荚膜，荚膜多糖是肺炎链球菌的主要致病因子，荚膜的存在可以包裹菌体表面的iC3b配体阻碍了CR4介导的补体系统从而抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作用，可以阻断机体产生的针对细菌表面蛋白的抗体的结合，从而导致细菌大量繁殖导致疾病的产生。肺炎链球菌的荚膜多糖具有多样性，至今已报道了超过98种血清型的荚膜多糖，根据抗原的相似性及交叉中和试验可分为46种血清组。目前所免疫肺炎链球菌疫苗主要由23价荚膜多糖疫苗和7价蛋白-多糖结合疫苗等血清型依赖型疫苗，仅能包含所流行血清型的80％左右，不能达到完全保护的效果。另外，由于新生儿的免疫系统发育不完全，肺炎球菌多糖疫苗不能够引起婴幼儿的免疫反应，也不能诱导免疫记忆。另一方面，由于抗生素的大量和不规范使用，导致范围内多重耐药的肺炎链球菌菌株的出现，在ZG也发现了携带青霉素结合蛋白(pbp)变异体以及Tn916型等多种转座子的多重耐药肺链菌株，这也给临床抗感染ZL带来了更大挑战。

 因此，研制新型GX的针对新生儿的肺炎链球菌感染引发的疾病的ZL性药物显得迫切需要。

近年来分子生物学的研究显示肺炎链球菌自身编码多种细胞壁裂解酶，称为自溶素包括LytA，LytB，LytC等。其中LytA是肺炎链球菌的主要自溶素，它是一种酰胺酶，主要引起肺炎链球茜在静止期发生自溶，在生长期主要作用于细菌分裂位置，帮助子代细菌分离。Peter Mellroth等2011年的研究中显示当胞外LytA浓度达到5μg/ml时能够立刻诱导静止期的菌体发生自溶(Mellroth P ,Daniels R ,Eberhardt A ,et al .LytA ,major autolysin of Streptococcus pneumoniae ,requires access to nascent peptidoglycan[J].Journal of Biological Chemistry ,2012 ,287(14):11018-11029 .)。LytA在结构上都分为N端的催化结构域和C端的胆碱结合域，由于肺炎练球菌的肽聚糖分子中含有胆碱，因此LytA可能特异性的结合在肺炎链球菌的表面发挥促溶作用。LytA的C端的胆碱结合域由6个重复的胆碱结合重复序列，因此设计具有较强胆碱结合能力的多肽序列，可作为肺炎链球菌的特异性ZL的潜在药物。

 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种新型的合成多肽，其具有与肺炎链球菌表面胆碱分子结合的特性，具有肺炎链球菌的YZ生长及促进自溶的能力；

本发明还有一个目的是提供一种新型的合成多肽在制备抗肺炎链球菌生长和促溶药物中的应用。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种合成多肽，包括：

(a)所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示。

(b)在(a)限定的合成多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多肽。

优选的是，所述合成多肽的相对分子量为2367 .64g/mol。

一种如上所述的合成多肽在制备抗肺炎链球菌生长和促溶药物中的应用。

优选的是，所述合成多肽对肺炎链球菌生长的ZDYJ浓度是25μg/mL。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)属于厚壁菌门-链球菌科是一种革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界，常寄居在正常人鼻咽腔中。

肺炎链球菌是一种条件致病菌，当宿主免疫力降低时就会发病。它是引起社区获得性肺炎、支气管炎、鼻窦炎、中耳炎、败血症以及脑膜炎等疾病的主要致病菌。

本发明的合成多肽对肺炎链球菌具有良好的YJ效果；具有促进静止期肺炎链球菌发生自溶的活性；此外本发明合成多肽制YJ和促溶活性具有广谱性，对肺炎链球菌标准菌株(ATCC49619)、肺炎链球菌多重耐药分离菌株(SWU07、SWU11、SWU25、和SWU27)都具相似的YJ及促溶活性；本发明提供的合成多肽作成本相较于其它材料成本更低，易于大规模生产，可应用于肺炎链球菌引发的疾病的预防和ZL中。

本发明至少包括以下有益效果：

DY、本发明合成多肽无毒，通过细胞毒性分析可知本发明合成多肽对293T细胞生长没有影响；

第二、本发明合成多肽对肺炎链球菌具有良好的YJ效果；

第三、本发明合成多肽具有促进静止期肺炎链球菌发生自溶的活性；

第四、本发明合成多肽制YJ和促溶活性具有广谱性，对肺炎链球菌标准菌株(ATCC49619)、肺炎链球菌多重耐药分离菌株(SWU07、SWU11、SWU25、和SWU27)都具相似的YJ及促溶活性；

第五、本发明提供的合成多肽作成本相较于其它材料成本更低，易于大规模生产，可应用于肺炎链球菌引发的疾病的预防和ZL中。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

图1为本发明所述合成多肽的YJ效果实验结果示意图；

图2为本发明所述合成多肽在血平板培养中的YJ试验结果示意图；

图3为本发明所述合成多肽的促溶能力试验结果示意图；

图4为本发明合成多肽YZ肺炎链球菌生长的广谱性实验结果示意图；

图5为本发明合成多肽对肺炎链球菌结合能力实验结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种合成多肽，包括：

(a)所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示。

(b)在(a)限定的合成多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多肽。

一个优选方案中，所述合成多肽的相对分子量为2367 .64g/mol。

一种如上所述的合成多肽，在制备抗肺炎链球菌生长和促溶药物中的应用。

一个优选方案中，所述合成多肽对肺炎链球菌生长的ZDYJ浓度是25μg/mL。

根据已有的胆碱结合序列，结合Swiss-Model在线软件进行结构分析，设计了一种合成多肽，氨基酸序列如SEQ ID No .1所示；

SEQ ID No .1：TGWVKDNGSWYYLNLSGYML。

(Thr-Gly-Trp-Val-Lys-Asp-Asn-Gly-Ser-Trp-Tyr-Tyr-Leu-Asn-Leu-Ser-GlyTyr-Met-Leu)

合成多肽的制备

选用氨基酸-王树脂作为载体2-Cl-Resin作为载体(树脂)进行多肽合成，用二氯甲烷将树脂充分溶胀，用二氯甲酰胺清洗几遍，用适当浓度的DBLK将Fmoc-保护基团脱出，之后用二甲基甲酰胺清洗数遍，洗去DBLK ,称取适量的缩合剂苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和活化剂甲基吗啉以及C端第二个Fmoc-保护氨基(Fmoc-Pro-OH)进行偶联，通过茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全，用二甲基甲酰胺清洗数遍，洗去残留的各种残基、活化剂和缩合剂，依氨基酸序列进行偶联，将所有的氨基酸连接结束后，脱去ZH的Fmoc-保护基团，用切割液裂解，去除树脂和氨基酸保护基团，得到合成多肽的粗品，采用C18、10um色谱柱进行纯化除杂，送质谱确认产品分子量2367 .64g/mol符合理论值。称量冻干后的纯品，经分析计算，产品纯度为95 .05％。

细胞毒性

实验方法：正常培养的293T细胞培养至汇合度约90％时，胰酶消化接种96孔细胞培养板，培养体系100Μl DMEM高糖培养基(含10％血清及1％双抗)。DY竖排5孔在细胞贴壁前，向培养基内加入10μL、5μL、2 .5μL、1μL、0 .1μL本发明合成多肽(1mg/mL)。第二竖排5孔

在贴壁后立即加入10μL、5μL、2 .5μL、1μL、0 .1μL本发明合成多肽(1mg/mL)。每排各留一孔作为对照。细胞于37℃二氧化碳培养箱内继续培养过夜，观察细胞状态。

实验结果：各组处理细胞生长状态均正常，生长速度相似，未观察到细胞病变及死亡。

YJ能力实验

实验方法：在灭菌2ml离心管中加入1mL无菌脑心浸液培养基(BHI)，向管内加入5μL肺炎链球菌菌液，向管内分别加入100μL、50μL、25μL、10μL、1μL本发明合成多肽(1mg/mL)，37℃静置培养每隔6h采用酶标仪测定100μL培养物的OD值。

实验结果：由图1可见，本发明所提供的合成多肽，25μg/mL对肺炎链球菌标准菌株ATCC49619，YJ效果随多肽浓度升高而增强。

注：将上述BHI培养基换为蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)时所检测到的YJ结果相似。

使用不同批次合成的相同序列的多肽，进行实施例4所述的YJ试验时，所获得结果相似。

血平板培养中的YJ试验

实验方法：将100μL本发明合成多肽(500μg/mL)用玻璃推棒涂布于1/2血平板中(约合1 .25μg/cm2)，使用接种环向血平板内涂布与未涂布区域划线ATCC49619菌株。划线血平板于37℃空气育培养箱中培养12h，观察细菌生长状态。

实验结果：由图2可见，在涂布有本发明合成多肽(1 .25μg/cm2)的区域A内，划线的ATCC49619菌株生长被完全YZ，未涂布区域B细菌生长状态良好。

促溶能力试验

实验方法：在灭菌2ml离心管中加入1mL无菌脑心浸液培养基(BHI)，向管内加入5μL肺炎链球菌菌液，37℃静置培养8h后，向培养基中分别加入100μL、50μL、25μL、10μL、1μL本发明合成多肽(1mg/mL)，间隔观察菌体状态。

实验结果：由图3可见，本发明所提供的合成多肽在100μg/mL处理15min时，肺炎链球菌标准菌株ATCC49619即发生自溶，溶菌效果随多肽浓度降低而减弱。

合成多肽YZ肺炎链球菌生长的广谱性试验

实验方法：在灭菌2ml离心管中加入1mL无菌脑心浸液培养基(BHI)，向管内加入5μL肺炎链球菌菌液(ATCC49619、SWU07、SWU11、SWU25、SWU27)各两管。向每个菌株的其中一管内添加25μL本发明合成多肽(1mg/mL)，培养12h测定100μL培养物的OD值。

实验结果：由图4可见，25μg/mL的本发明合成多肽对上述菌株均有不同程度的YZ效果。

本发明合成多肽对肺炎链球菌结合能力试验

实验方法：肺炎链球菌标准菌株ATCC49619采用BHI培养基于5mL离心管中培养至OD约0 .5时，取400μL离心收集菌体(约4×106CFU/mL)。使用蒸馏水洗涤、重悬菌体，离心收集菌体，重复3次。向菌体中加入40μL梯度稀释的本发明合成多肽，重悬混匀于37℃培养箱孵育30min。离心收集上清于另一离心管中。使用NanoDrop2000测定处理与未处理各稀释度多肽浓度。

实验结果：由图5可见，本发明合成多肽对肺炎链球菌标准菌株ATCC49619具有结合活性，经过计算结合活性约为2 .74×105CFU/μg。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

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