单细胞分选器测序的样本操作原则和注意事项
2022-06-24446单细胞分选器是一种用于生物学、农学领域的分析仪器。单细胞分选器可以在显微镜直接观察下,根据细胞形态学,荧光标记或位置,从贴 壁,悬浮和三维细胞培养系统,快速精确采集感兴趣的单细胞或细胞团。本仪器可 以在实验室常规使用的细胞培养器皿上直接采集细胞。
1、单细胞分选器测序的样本要求
(1)样品总量:细胞悬浮液,欧易上门提取一个样本细胞起始量大于 1×10 5 个;
(2)样品浓度:5×10 5 - 1.2×10 6 / mL,最 低需要 1×10 5 / mL;
(3)细胞活性:活细胞数在 90 %以上;
(4)细胞大小:小于 40 µm;
(5)细胞培养基及缓冲液不能含有 Ca 2+ 和 Mg 2+ 等影响酶活性的物质;
(6)组织需解离成单细胞悬液,植物细胞需制成原生质体。
2、单细胞分选器测序的样本准备原则
(1)建议使用宽枪头重悬,以减少对细胞的损伤;
(2)每次移液前先混匀细胞悬液,然后从管中部吸取;
(3)所有环节都最 好在无菌环节下操作、使用无核酸酶的试剂、减少移液步骤以及当可能损伤细胞的时候尽量使用宽枪头等。此外,可用一次性转液管去除离心后的上清液,以减少细胞沉淀的干扰;
(4)取样的时候最 好设置两个重复,对每个样品计数 2 次,即共计 4 次计数;
(5)弃上清时候注意不要破坏细胞沉淀;
(6)某些细胞如 hPBMCs 在 PBS 中易成团状,从而降低细胞有效浓度,因此制备细胞悬液需迅速,最 好在 30 分钟内完成;
(7)最 佳上样体积为 2.5 µL-15 µL,建议上样前根据实际需要上样细胞数调整单细胞悬液浓度;
(8)对于直径较大的细胞如永生化细胞株建议室温下 150 rcf 离心 3 min,对于直径较小的细胞如PBMCs 建议室温下 300 rcf 离心 5 min;
(9)重悬细胞浓度建议不要超过 5000 cells/ µL,最理想的范围保持在 700-1200cells/ µL,此浓度下计数较为准确;
(10)一般选用含 0.04% BSA(400µg/ mL)的 1× PBS 溶液重悬细胞。但 PBS并不适用于所有细胞,如原代细胞、干细胞等敏感细胞类型可能需要另换缓冲液以最 大 程 度保证活性,已确定以下溶液对人293T/17 和小鼠 NIH/3T3 细胞系的10 ×单细胞操作无影响:
a. Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline(DPBS);
b. Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)。
若在上述缓冲液中无法保证活性,可以选用细胞培养基洗涤细胞,以下培养基已确定对人 293T/17 和小鼠 NIH/3T3 细胞系的 10×单细胞操作无影响:
Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)+ 10% FBS;
Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)+ 10% FBS;
Iscove’s Modified Eagle Medium(IMEM) + 10% FBS;
Roswell Park Memorial Institute(RPMI)+ 10% FBS;
Ham’s F12 + 10% FBS;
1:1 DMEM /F12 +10% FBS;
M199。
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