单细胞分选器相关技术的介绍

       单细胞分选器从复杂样本中分离单个细胞是单细胞研究的普遍需求，对未培养微生物的分离与培养也至关重要，生物成像、生物识别、生物材料等技术的不断进步，促进了一系列单细胞分离技术的产生与发展，这里简要介绍几种常用的单细胞分离技术及其在微生物研究中的应用。

       1.显微操作技术

1970年起，Johnstone等开始使用微注射器和微毛细管等工具来进行微生物的显微分选，但由于显微物镜的放大倍率与工作距离之间的相互制约，几乎不能进行单细胞的分离。随着长工作距离、高放大倍率的显微物镜的出现，显微操作技术有了很大的改进，人们可以通过倒置显微镜对放大1000倍(包括电子放大倍率)的微生物进行观察，结合精 准的压力控制装置，可以准确地放置毛细管以实现对微生物细胞的分离。如今也有商业化的显微操作产品，Hohnadel等通过使用商业显微操作仪(Eppendorf Transfer Man 4R)，结合倒置显微镜实现了对多种微生物(Escherichia coli、Bacillus cereus、Staphylococcus aureus、Bacteroides vulgatus、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa和Candida albicans)的分离培养，并应用于食品安全领域。Fröhlich等通过显微操作成功从混合样品中挑取出10个单细胞克隆，培养后经鉴定分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄 色葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus)、硫酸盐还原菌(Desulfovibrio desulfuricans)。Ishoy等通过显微操作对意大利一温泉泥土样品进行单细胞分选，得到金属球菌(Metallosphaem sedula)和硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)。尽管商业化的显微操作分离产品可以通过更换不同孔径的毛细管来实现对不同尺寸微生物的分离，但需要在多次实验中完成。此外显微操作技术只可以分选液体样本，并不适用于固体样本中微生物的分离，且通量较低，难以实现大规模的微生物分离。

       2. 荧光活化细胞分选

荧光活化细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting，FACS)是一种发展迅速、广泛使用的细胞分选技术。流式细胞仪(flow cytometer)就是以FACS技术为核心，通过流体控制技术使得细胞悬液成单行流动，检测细胞的荧光信息，并通过压电晶体喷出带有不同电荷的液体来包裹每一个细胞，当包裹着细胞的液体流经电场就会偏转到不同的接收装置中。因其具有测量指标多、检测速度快等优点，被广泛应用于临床医学、细胞学、微生物分离等领域的科学研究中 。Zengler等将菌液样本稀释后与融化的琼脂糖混合，形成包裹着微生物单细胞的微滴胶囊，再结合流式细胞仪，将形成的微液滴胶囊分选到含有培养基的96孔板中培养，最 终获得纯培养微生物并进行16S rRNA测序，在得到的150株细菌中有71株细菌分类于常见细菌分支中，剩余细菌不存在于环境基因库中，是此前尚未培养的 。Scott等通过流式细胞仪实现对厌氧菌(Clostridium thermocellum，Caldicellulosiruptor obsidiansis，Thermotoga maritima，Pyrococcus furiosus)以及生长缓慢微生物的高通量分离培养  。FACS技术在微生物研究领域发挥了重要作用，但也存在一定局限性。例如，FACS通常要求样品本身具有荧光或对样品进行荧光标记，这需要对目标细胞的表型有预先认知，而未培养微生物通常为完全未知的细胞，难以进行荧光标记；而即便对于那些可以标记荧光的微生物细胞，外源标记也有可能给细胞带来某些影响以至于在实际研究中不能适用。此外，FACS技术需要待分离目标在群落中具有一定浓度，这使其难以对环境中的低丰度微生物进行分离。

       3.微流控分选

基于微流控芯片的分选研究近些年较为热门。微流控分选(microfluidic isolation)是一种利用微米级的微管道来操控纳升甚至皮升级流体的技术 ，能够精 准控制细胞。目前已经有用于单细胞基因组学、转录组学分析的微流控产品 。此外很多实验室也开发出多样化微流控芯片设备用于特定的研究，比如中国科学院微生物研究所通过微流控设备与传统培养平皿相结合的方法，实现了微生物细胞的高通量分离与培养，并将其应用于土壤微生物样本，发现了多种能够高效降解多环芳烃的微生物 。Hosokawa等通过微流技术在微流控芯片内形成10 pL大小的微液滴，并观察Escherichia coli和Saccharomyces cerevisiae 2种微生物的生长情况，实现了2种微生物的高通量培养[20]。Yin等进一步设计一种Y形微流控芯片，结合拉曼光谱技术对微生物进行识别，通过程序控制芯片通道的压力与拉曼信号同步，将目标微生物输运至指定腔室内  。Hmelo等指出微流控芯片在探索微生物微环境中的应用，比如探索不同理化性质下微生物的状态、微生物间的相互作用、微生物抗性、实现单细胞分选以及高通量等相关应用 。微流控分选技术的优势在于操作灵活、集成化、速度快等，但由于自然界中的微生物通常形态各异，且含有许多大小不一的微颗粒杂质，在分选时容易发生管道堵塞等问题，限制了此技术在微生物分离培养领域的大规模应用。

       4.光镊分选

1986年，Ashkin等利用经高数值孔径聚焦的单束激光实现了对电介质微球的三维捕获，标志着光镊技术的诞生 。随后科学家对光镊的研究达到空 前的重视程度，使其在生物医学、生命科学中得到了广泛应用。与机械镊子相比，光镊是一种以非机械接触的方式来完成对微小物体的夹持、操纵、捕获和固定，近几十年的发展表明，光镊力的大小在0.1皮牛到几百皮牛范围 ，此外通过选用适当波长的激光，可使形成的光镊对物质的热学或化学等效应非常弱，从而几乎不对细胞产生任何损伤。光镊技术所使用的光学力具有靶向性和非侵入性，是能够精确操纵生物样本的基础，从几纳米大小的单分子 到几十微米的单个微小器官 。光镊技术应用于微生物分选依赖于微流控技术，其优势在于可以结合拉曼光谱等技术，根据微生物的拉曼光谱信息对微生物进行分选。微流控控制微生物样本在芯片中流动，通过光镊捕获之后进行拉曼检测，当检测是目标样品，通过光镊进行分选至收集区通道，而非目标样品则松开后流入废液区(图 1)。Huang等结合光镊和拉曼技术，通过标记所产生的拉曼光谱位移来识别微生物，然后通过光镊移动微生物进行基因测序和微生物培养，在所分选的18个酵母细胞(Saccharomyces cerevisia)和18个荧光菌(Pseudomonas fluorescens)中，分别有11个酵母细胞和7个细胞成功培养。光镊技术在细胞分离中具有低损伤、可视化等优势，但由于设备操作较为复杂，单细胞分离效率较低，在实际应用中受到一定限制。

       5.基于激光诱导向前转移技术的细胞分选

激光诱导向前转移技术(Laser-Induced Forward Transfer，LIFT)是一种基于光与物质作用的新型可视化微生物细胞分离技术。其通过成像物镜观察锁定目标细胞，通过弹射物镜将激光聚焦到目标细胞进行弹射分选，控制接收装置配合实现目标细胞的接收。与荧光活化细胞分选等分离技术相比，LIFT细胞分选技术由于是镜下分选，有着更高的显微分辨率，可根据目标微生物细胞的形态、尺寸、荧光及拉曼分子指纹等多种特征进行分选，分选后的细胞能够直接用于扩大培养或全基因组扩增及测序等，单细胞获得率高、适用范围广泛。