人核转录因子-κB亚基p65亲和肽ELISA试剂盒操作步骤

文档简介人核转录因子-κB亚基p65亲和肽ELISA试剂盒操作步骤使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）水平。用纯化的人核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65），再与HRP标记的核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人核转录因子-κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）浓度。操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。480pg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液240pg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液120pg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液60pg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液30pg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品Z终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月