细胞如何做好转染实验及提高实验效率

文档简介细胞如何做好转染实验及提高实验效率①从健康细胞开始Ⅰ转染实验前，细胞解冻后传代34次。这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。Ⅱ仅使用活性>90%的细胞使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。Ⅲ定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。a.请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper试剂(Corning25-056-CI)使细胞脱壁。Cellstripper试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的Cellstripper来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。b.传代条件取决于所用的细胞系。部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。Ⅳ保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。传代次数高(>3040)时，细胞的生长速度和形态会改变。②进行实验之前，请先规划您的实验。务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。Ⅰ开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。Ⅱ计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning40-300-CVR)，Lipofectamine2000或LipofectamineLTX试剂，以及DNA(0.51g/L)。③转染时，请使用优质DNA。Ⅰ使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。Ⅱ通过测量OD260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.71.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。Ⅲ在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。Ⅳ制备的工作浓度为0.51g/L。可用SpeedVac浓缩仪或透析过滤装置(例如，MilliporeAmicon超滤管)来浓缩DNA。④转染当天，将细胞铺板。Ⅰ如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降。Ⅱ转染时，细胞密度保持在汇合率为7090%。Ⅲ转染时，细胞密度影响转染效率。为了简化转染优化过程或节省时间，我们建议细胞铺成2种不同的密度，以确保较高的转染效率。Ⅳ细胞的铺板和转染可同时进行，或者通过反向转染操作进行。反向转染操作中，使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。Ⅴ转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中，且不会影响转染效率。