产品资料

细胞色素P450亚酶1A2活性荧光定量检测试剂盒说明书

上海科学仪器有限公司 2018-11-18
文档简介细胞色素P450亚酶1A2活性荧光定量检测试剂盒产品说明书主要用途细胞色素P450亚酶1A2活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过甲氧基异酚唑脱甲基酶反应系统中甲氧基异酚唑转化为羟基异吩唑酮后荧光峰值的变化,即采用荧光法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品(动物、人体)或纯化微粒体样品细胞色素P450亚酶1A2的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。技术背景细胞色素P450亚酶1A2,简称为CYP1A2,是肝细胞微粒体复合功能氧化酶系统的成员之一,也是芳香族碳氢化合物加羟基酶(arylhydrocarbonhydrorylase;AHH)的成员之一。在人体肝脏里占P450酶系15%。与CYP1A1高度同源,特别是在外显子2、4、5和6。CYP1A2由多个多态性变体,Z常见的是:1A和1F,与kafeiyin代谢和迟发性皮肤卟啉症(porphyriacutaneatarda)相关。CYP1A2的作用在于体内外源化合物(xenobiotics),包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢,即单加氧化作用(monooxygenation)和羟化作用(hydroxylation),以及脂类合成包括胆固醇和类固醇。芳香族碳氢化合物诱导CYP1A2的表达。甲氧基异酚唑脱甲基酶(7-methoxyresorufin-O-demethylase;MROD)的活性是细胞色素P450亚酶1A2的诊断标记,其基于MROD选择性催化细胞色素P450亚酶1A2的活性。甲氧基异酚唑(7-methoxyresorufin)在甲氧基异酚唑脱甲基酶的催化下,转化为羟基异吩唑酮(resorufin)后荧光峰值的变化(激发波长530nm,散发波长590nm),来定量测定细胞色素P450亚酶1A2的活性。甲氧基异酚唑脱甲基酶反应系统为:产品内容缓冲液(ReagentA)毫升反应液(ReagentB)毫升底物液(ReagentC)微升标准液(ReagentD)微升产品说明书1份保存方式保存在-20℃冰箱里,底物液(ReagentC)和标准液(ReagentD)避免光照,有效保证6月用户自备1.5毫升离心管:用于标准样品操作的容器恒温水槽:用于孵育反应比色皿或酶标板:用于反应和比色的容器荧光分光光度仪或酶标仪:用于荧光分析实验步骤实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、测定准备1.准备好待测样品(例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等),置于冰槽里2.设定好荧光分光光度仪(温度为37℃):激发波长530nm,散发波长590nm,并置零3.准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管4.加入xx微升缓冲液(ReagentA)到1号管5.分别加入xx微升缓冲液(ReagentA)到2至5号管6.移取xx微升标准液(ReagentD)到1号管,混匀7.小心移取xx微升1号管稀释的标准液(ReagentD)到2号管,混匀8.小心移取xx微升2号管稀释的标准液(ReagentD)到3号管,混匀9.小心移取xx微升3号管稀释的标准液(ReagentD)到4号管,混匀10.将1至5号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表管号缓冲液(ReagentA)标准液(ReagentD)标准羟基异吩唑酮浓度1微升微升纳摩尔/升2微升微升1号管纳摩尔/升3微升微升2号管纳摩尔/升4微升微升3号管纳摩尔/升5微升00二、标准曲线测定1.移取xx微升缓冲液(ReagentA)到新的比色皿2.加入xx微升反应液(ReagentB)3.加入xx微升底物液(ReagentC)4.加入xx微升上述配制的标准液5.上下倾倒数次,混匀6.在37℃温度下孵育10分钟7.即刻放进荧光分光光度仪检测获得相对荧光读数8.重复实验步骤1至7四次9.构建标准曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位;横座标(X轴)为标准羟基异吩唑酮浓度(纳摩尔/升)三、样品测定1.移取xx微升缓冲液(ReagentA)到新的比色皿2.加入xx微升反应液(ReagentB)3.加入xx微升底物液(ReagentC)4.加入xx微升待测样品(20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈)5.上下倾倒数次,混匀6.在37℃温度下孵育10分钟7.即刻放进荧光分光光度仪检测:获得相关荧光读数8.(选择步骤)重复实验步骤1至7,测读新的样品9.根据标准曲线获得样品对应羟基异吩唑酮浓度四、计算样品活性[根据标准曲线获得样品对应羟基异吩唑酮浓度(纳摩尔/升)X样品稀释倍数]÷10(分钟)]=皮摩尔/毫升/分钟÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=皮摩尔/毫克/分钟五、酶标板测定1.在96孔酶标板上做好相应标记:标准样品和待测样品2.分别移取xx微升缓冲液(ReagentA)到相应孔中3.分别加入xx微升反应液(ReagentB)4.分别加入xx微升底物液(ReagentC)5.分别加入xx微升上述配制的标准液或待测样品(20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈)6.轻轻摇动96孔酶标板7.在37℃温度下孵育10分钟8.即刻放进荧光酶标仪检测:获得相对荧光读数9.构建标准曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位;横座标(X轴)为标准羟基异吩唑酮浓度(纳摩尔/升)10.根据标准曲线获得样品对应羟基异吩唑酮浓度11.活性计算:[根据标准曲线获得样品对应羟基异吩唑酮浓度(纳摩尔/升)X样品稀释倍数]÷xx(反应时间;分钟)]=皮摩尔/毫升/分钟÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=皮摩尔/毫克/分钟注意事项1.本产品为25次(比色皿)或85次(酶标板)操作,包括标准液2.操作时,须戴手套3.系统操作过程中,标准液测定只需1次4.样品须澄清,至关重要(本公司提供细胞可溶性总蛋白质制备试剂盒30002.1)5.孵育反应完成后即刻进行荧光测定6.如果酶活性过低,可以增加反应时间至30分钟7.荧光测定后,比色皿须清洗彻底8.建议待测样本为微粒体,其蛋白浓度为20微克/100微升;待测样本为细胞裂解悬液,其蛋白浓度为100至200微克/100微升(本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1)9.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度10.通常人体细胞微粒体细胞色素P450亚酶1A2活性浓度为:200-600皮摩尔/分钟/毫克蛋白11.细胞色素P450亚酶CYP1A2单位活性定义为:在37℃,pH7.5条件下,每分钟内能够转化1纳摩尔甲氧基异酚唑至羟基异吩唑酮所需的酶量作为一个活性单位12.本公司提供系列毒理学检测试剂产品质量标准1.本产品经鉴定性能稳定2.本产品经鉴定检测敏感
您可能感兴趣的产品资料