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冰冻切片的免疫组化染色操作步骤

上海恒远ELISA试剂盒供应商 2018-11-16
文档简介冰冻切片的免疫组化染色操作步骤1.新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5~6μm。2.载玻片可不打底,裱片后,立即用电吹风吹干。3.如不马上染色,可密封后-20℃保存。4.染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。5.PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)6.3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;7.用PBS洗2次,每次5分钟;8.正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清(与第二抗体同源动物血清)处理,37℃,15分钟。附:正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制):按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50μ+5μl(10%抛洒量)计算。9.滴加**抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加**抗体,37℃2小时(也可置于4℃冰箱过夜)。10.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。11.滴加生物素化的二抗,37℃,40分钟。12.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。13.滴加三抗(SAB复合物),37℃,40分钟。14.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。15.DAB显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止)。附:DAB的配制①储备液(DAB25mg/ml)的配制:DAB250mg+PBS10ml,待完全溶解后分装成1ml,100μl,50μl,20μl等,-20℃,冻存。②工作液:DAB储备液20μl+PBS1000μl+3%H2O25μl16.自来水(细水)充分冲洗。17.苏木素复染,室温,30秒,自来水冲洗。18.自来水冲洗返蓝,15分钟。19.梯度酒精脱水:80%,2分钟95%,2分钟1**%,2次,5分钟。20.二甲苯透明:I,II(二甲苯)各5分钟21.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。
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