还原性谷胱甘肽GSH检测方法推荐

文档简介Beutler改良法测定组织GSH操作规程原理及意义原理：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色，在412nm波长下有吸收峰。意义：还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除O2、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，Z近还证明GSH也参与使VitE恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。器材可见光分光计、7ml离心管和管架、加样器和枪头试剂①1mmol/L的GSH（标准品）；②1％柠檬酸钠；③二硫双基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid,DTNB）试剂：用1％柠檬酸钠配成终浓度0.04％（w/v）；④20％三氯醋酸；⑤0.3mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）缓冲液。步骤1、样品处理及试验步骤（下面以肝脏组织为例）称取一定量的肝脏组织于冰冷0.85％生理盐水中漂洗，滤纸吸干表面水分，烧杯内剪碎制备20%组织匀浆液（须用0.85％生理盐水或三蒸水）4000g离心10min后取上清液按上清液:20％三氯醋酸（体积比）为2:1混合（加TCA前留取20μl上清液用于Lowry法测蛋白）混匀，4000g离心10min（此步离心要充分，可适当提高离心力）收集上清液按表2测定。2、按下表1绘制标准曲线（单位：ml）表1GSH标准曲线的测定GSH（μmol/L）010203040501mmol/L的GSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.5混匀，5min内于412nm比色，以三蒸水调零，以标准GSH浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。3、按下表2操作测定样品GSH（单位：ml）表2Beutler改良法样品测定操作试剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.1测得的吸光值代入回归方程，可计算出样品液的GSH浓度。实验结果1、标准曲线结果GSH浓度（μmol）00.050.10.150.20.2值0.0000.1260.2600.3940.5290.666根据上数据测得标准曲线方程为：X(μmol)=0.3744898Y+0.0017227（其中Y为吸光值，标准曲线看Figure1）Figure1GSH标准曲线图注意事项样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低；所有用水均需三蒸水，否则结果偏低；未经蛋白变性处理的样品在－20℃不宜存放；反应管内Z终PH值必须保证在8.0～9.0间，否则结果不稳定；配好的DTNB应在有限期内使用（4℃下可存1个月）；GSH浓度低时显色快，消退也快；浓度高时显色慢，消退也慢，一般反应1～5min后测定（**不要超过5min）；反应总体积可调为2.5ml。