ELISA操作常见问题及其解决方法

文档简介ELISA操作常见问题ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败Z为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。Z为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。更多ELISA操作常见问题及其解决方法请见附件......