线粒体呼吸链复合物V活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

文档简介MB50083v.A线粒体呼吸链复合物V活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途线粒体呼吸链复合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定与ATP合成对应的ATP水解产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特异性活性检测。可用于心肌、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景线粒体呼吸链复合物V，通常称为ATP合成酶（ATPsynthase）、F型ATP酶（FtypeATPase）和F1F0ATP酶（F1F0ATPase），是线粒体氧化磷酸化的反应。其分子量为500KD，含有十六个亚单位，其中两个：ATP酶6和8为线粒体DNA编码的。ATP酶主要有两个结构域：F0为质子通道，由几个膜蛋白构成，包括a、b、c、d、e、F6、A6L、OSCP（oligomycinsensitiveconferringprotein）等；和F1催化活性结构域，由水溶性的α3β3γδε蛋白构成。其Z特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。复合物V的主要功能在于产生大部分细胞所需的能量ATP。ATP的合成需要线粒体内膜电子传递到氧分子时，呼吸链蛋白所产生的质子梯度变化。质子通过F0结构域传递到基质，激活F1催化活性结构域，促使ATP合成。该酶异常会导致心肌和神经系统疾病。基于ATP，在寡霉素参与下，受到F1F0ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvatekinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reducednicotinamideadeninedinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析F1F0ATP酶活性。其反应系统为：F1F0ATPaseATP=ADP+PipyruvatekinasePhosphoenolpyruvate+ADP→pyruvate+ATPlactatedehydrogenasepyruvate+NADH→lactate+NAD+（高吸收峰）（低吸收峰）产品内容缓冲液（ReagentA）20毫升反应液（ReagentB）2.5毫升阴性液（ReagentC）2毫升底物液（ReagentD）500微升专性液（ReagentE）250微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（ReagentB），避免光照，有效保证6月用户自备比色皿：用于光度分析的容器分光光度仪：用于光度分析培养箱：用于孵育反应物实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；反应液（ReagentB）注意避光。然后进行下列操作。测定准备准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔30秒，读数11次（共5分钟），并置零缓冲液（ReagentA）室温下均衡温度背景对照测定移取780微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿加入100微升反应液（ReagentB）加入20微升底物液（ReagentD）放进30℃培养箱里孵育3分钟加入100微升阴性液（ReagentC）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟样品总活性测定移取780微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿加入100微升反应液（ReagentB）加入20微升底物液（ReagentD）放进30℃培养箱里孵育3分钟加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟样品非特异活性测定实验开始前，移取100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）到1.5毫升离心管，加入20微升专性液（ReagentE），混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后置于冰槽里备用移取760微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿加入100微升反应液（ReagentB）加入20微升底物液（ReagentD）放进30℃培养箱里孵育3分钟加入120微升上述预处理的待测样品上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟计算样品活性1）样品活性（总活性和非特异活性）【（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.1（样品容量；毫升）X6.22（毫摩尔吸光系数X1或5（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔NADH/分钟2）样品特异活性样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性