半胱氨酸蛋白酶试剂盒检测说明

文档简介半胱氨酸蛋白酶试剂盒检测说明该试剂盒以HRP标记的链霉亲和素复合物（HRPStreptavidinConjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性caspase-3抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的caspase-3一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，Z后加入HRP-SA，形成抗原特异一抗生物素化二抗HRP-SA复合物，显微镜下观察成像。试剂盒所含试剂：试剂A通透液：0.1%Triton-X10010mL（选用）试剂B封闭缓冲液（封闭用）20mL试剂C（原装进口分装）已稀释的即用型caspase-3一抗（2.5ml）试剂D（原装进口分装）生物素化羊抗兔IgG1支（浓度1.5mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50μL+抗体稀释液20ml试剂EHRP-SA复合物1支（浓度1μM，稀释比1:50~1:200）100μL试剂FDAB显色液5ml用户自备试剂：1．10mMTBS（pH7.2~7.4）三羟基氨基甲烷1.21g氯化钠7.6g加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2~7.4，Z后定容至1000mLTBS-T：TBS+Tween20（0.05%体积比）2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液）10mMpH6.0柠檬酸缓冲液柠檬酸0.38g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，Z后定容至1000mL或：0.5MEDTA修复液（pH8.0）EDTA2H2O186.1g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水700mL，用10mMNaOH调pH值至8.0，Z后定容至1000Ml3.缓冲甘油封固剂10mL4.Tween205mL石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤（建议方案）：石蜡包埋组织切片3~4μm厚度1.烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1hr；2.脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10min；3.水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O洗2×2min；4.抗原修复：根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗涤（2×2min）（具体修法见附1）*注：有些抗原勿需修复，直接进入第5步封闭。5.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育30min；6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2hr或4℃；7.洗涤：TBS-T洗涤（3×5min）；8.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育10min；9.加二抗：滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30min；10.洗涤：TBS-T洗涤（3×5min）；11.封闭：滴加试剂Tween20，37℃湿盒孵育封闭20min；12.加HRP-SA：滴加用抗体稀释液稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20nM），37℃湿盒中孵育30min；13.洗涤：TBS-T洗涤（3×5min），TBS洗涤（2×5min）；14.显色：应用DAB溶液（试剂F）显色；15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；16.封片：待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；17.观察成像：显微镜下观察成像。注意事项：1.修复后缓冲液须自然冷却，自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。2.缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。3.若试剂为微量浓缩液，用前应低速离心，将内盖和管壁附着的溶液离到底部。4.封片前一定要换用TBS充分洗涤，以便洗去组织上残留的Tween20，否则会影响结果观察。5.如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。附附11：抗原修法常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（0.01MpH6.0）、EDTA抗原修复液（pH8.0或9.0）等等。一、酶消化修复法切片脱蜡水化处理，TBS冲洗，在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min后TBS冲洗即可。二、微波抗原修复法微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档或继续微波10~15min，取出微波盒冷却至室温后，自来水冲洗，取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整。三、直接高压抗原修复法取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上，修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时1.5~2.5min即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。四、隔水式高压抗原修复法不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾，微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾，将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖，待喷气后计时4~8min即可关闭热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。