原代细胞分离技术

文档简介实验步骤1.悬浮细胞的分离方法1）将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。2）去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。3）用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。4）如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。2.实体组织材料的分离方法1）机械分散法a.纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。b.用PBS清洗两次后①用吸管吹打，分散组织细胞。②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。c.收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。d.去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。2）消化分离法酶消化分离法（冷消化法）a.细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。b.再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。c.加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃。d.次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。e.加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。非酶消化法（EDTA消化法）a.把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。b.将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。c.加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。d.弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。e.用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。