酶联免疫电泳转移分析法

文档简介该法是分析蛋白质的一种新方法，由southernblot衍化而来，后者是由SouthernE.M.所创建，即将在琼脂糖凝胶中电泳后的DNA，原位吸附于硝酸纤维素膜上，再用放射性同位素如32P等标记的单链RNA或DNA探针，与板上的核酸分子杂交，从而达到分析DNA中基因位置和顺序的目的。以后Alwine等采用另一种固相化的重氮苄氧甲基薄膜，以共价键方式和电泳后的RNA连接，从而固相化于薄膜上，再用分子探针杂交，分析RNA核酸的结构，由于此法与southernblot相对，故称之为northernblot。接着，Towbin等又将在聚丙烯酰胺凝胶上电泳后的蛋白质按其原来的图形，电泳转移到硝酸纤维素膜上，再用酶标记的抗蛋白质抗体分析蛋白质电泳图谱，现称之为westernblot，即酶联免疫电泳转移分析法或免疫印迹法（immunoblotting，IB）。其基本程序是先将待测蛋白质混合物标本点在板状聚丙烯酰胺凝胶板孔上走一维或二维电泳，使样品中的单一成分分离出来，然后取硝酸纤维素膜与电泳后的凝胶相贴，在电场方向与板面垂直的条件下，进行转移电泳，此时，蛋白质在电场力及印迹纸的自然吸附力的共同作用下，使各个单一成分进入硝酸纤维素膜，并固相化。该膜即可用作蛋白质活性分析或免疫反应分析。硝酸纤维素膜上未吸附蛋白的活性，可用牛血清白蛋白或非离子型去垢剂灭活。然后与**抗体温育、洗涤，再与酶标第二抗体温育、洗涤、酶底物显色，进行蛋白质活性等分析。IB法的优点是，不同的抗原成分在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，然后转移并固相化于硝酸纤维素膜上，进行抗原抗体反应时，不受其他条件的限制，加上酶标抗体的放大作用，可以鉴定微量或低效价的抗体。这样使SDS（十二烷基硫酸钠）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与ELISA的高敏感性相结合，可广泛用于McAb等的筛选和鉴定等。另外，将新建立的两项与ELISA有关的检测法简介如下：①IgM抗体捕捉酶联免疫吸附试验（IgMantibodycaptureELISA,MAC-ELISA），又称反向间接ELISA，即利用抗μ链特异性抗体包被固相载体，吸附待检血清中的IgM,再加入特异性抗原与“捕捉”到的相应IgM抗体结合，然后加入酶标记抗体及底物进行测定的一种方法，该法的特异性及敏感性均较高，不受血清中IgG等的干扰，可用于各种感染性疾病的早期辅助诊断；②ELISPOT测定法，用已知抗细胞因子的抗体包被固相载体，加入待检效应细胞，温育一定时间，洗去细胞，如细胞在温育过程中有相应细胞因子产生，加酶标记抗体及底物溶液后则显色，该法用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定。若用已知抗原包被固相载体，也可测定分泌特异抗体的B细胞频数。