miRNA定量及均一化cDNA文库技术

文档简介进行一次逆转录即可实现所有目标miRNA的测定？没错，采用加尾法，一次逆转录就可以得到全部miRNA对应的cDNA。我们知道，真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的，这样Oligo-dT（逆转录引物）就很容易结合到mRNA上来合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴，怎么办呢？在逆转录试剂盒中加入poly-A聚合酶，先给它们加上一串poly-A尾巴，然后用带有一段通用序列的Oligo-dT和逆转录酶来合成cDNA。这样一来，一次逆转录反应就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA对应的cDNA，接下来想用来检测什么都可以！您只需要提供1μg合格的totalRNA，就可以对所有感兴趣的miRNA进行检测。这既可避免茎环法（各目标miRNA单独逆转录）带来的逆转录效率、加样误差等方面的影响，还可节约多条特异逆转录引物和多次逆转录反应的花费，可谓一举两得，何乐而不为？均一化cDNA文库基因转录水平上的巨大差异常常给文库筛选和分析带来障碍，采用均一化文库技术可有效克服这一问题。　均一化cDNA文库具有以下4方面的优点：**，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度mRNA的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了mRNA丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序。现在，在构建均一化的cDNA文库中至少有2种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火条件下复性的速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。**种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到Z适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组DNA饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。DSN（duplexspecificenzyme）是Z近发现的一种热稳定核酸酶（Shagin.,2002）。该酶能够选择性降解双链DNA和DNARNA杂交体中的DNA，对单链核酸分子几乎没有作用。同目前常用的均一化技术相比，基于DSN的均一化技术操作步骤简单，所需要的起始材料也比较少，具有较好的应用前景。上海欧易生物医学科技有限公司开展miRNA定量检测服务已经近三年时间，服务项目几百个。拥有自己的miRNA引物库（人类），对其他物种可以自行设计引物，检测样品范围广，包括：细胞、组织、血液、血浆、血清、细胞培养上清等，操作规范，时间可控，为广大研究工作者提供了良好的便利。同时，其作为国内cDNA文库构建的主流服务供应商，在长期稳定的实验服务过程中积累了丰富的经验，已经成功构建包括动物、植物、细菌等几十个物种的cDNA文库。他们基于双链特异性核酸酶（Duplex-SpecificNuclease,DSN）的先进cDNA文库均一化技术，能减低高丰度表达基因100倍以上，有效富集低丰度表达基因，从而降低冗余率。