ELISA技术测定单克隆抗体效价方法

文档简介1.深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。　　2.掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。　　二、实验原理　　ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的GX催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA试剂盒是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA法中.酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗（抗抗体）、三抗再次进行免疫反应。　　目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。　　三、仪器、原料和试剂　　仪器　　聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。　　原料　　单克隆抗体　　试剂　　1.抗原及酶标记抗体　　①抗原：兔抗人IgG（RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423）;　　②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP（RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260）;均为　　DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。　　4.洗涤液（含0.05%Tween20的PBS）：1LPBS中加入Tween-20500μL。　　5.ELISA试剂盒封闭液（含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween20的PBS）：10mLPBS中加入100mgBSA，10μLTween-20。6.底物溶液　　①磷酸钠盐缓冲液（0.1mol/LpH6.0）：称Na2HPO412H2O2.2g，NaH2PO42H2O6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL。　　②TMB贮液：称60mgTMB溶于10mL二甲基亚砜中，4℃避光保存。　　③底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TNB贮液10μL。30%H2O215μL，混匀。　　7.终止液：2mol/LH2SO4　　四、操作步骤　　①抗原包被：兔抗人IgG作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板　　中。4℃放置。　　②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。　　③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h。　　④洗涤：用洗涤液洗3次。　　⑤加待测样品（一抗）：将含单克降抗体的细胞培养上清在另块板上用PBS连续稀释（按照1：2或1：10），100μL/孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h。　　⑥洗涤：用洗涤液洗3次。　　⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l：8000稀释，100μL/孔，加盖37℃恒温箱温育1h。　　⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。　　⑨显色：ELISA试剂盒加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。　⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液.颜色变黄;用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，阳性反应的Zda稀释度为待测样品的效价。