酶联免疫吸附检测法（ELISA）测定植物激素含量

文档简介酶联免疫吸附检测法（ELISA）测定植物激素含量一、原理植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一种类型。在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体（识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白），称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。A.固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体（Mab）与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体（RAMIG）结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与固相化的Mab结合，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记激素（酶标激素）。通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。B.固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）包被于固相载体，加入待测激素（样品或标准品）和抗IAA多克隆抗体（Pab）反应，进行竞争反应。然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体（HRP-GARIG）与结合在固相上的Pab反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：高等植物、真菌、藻类等组织或器官。（二）仪器设备：1.酶联免疫检测仪；2.高速冷冻离心机；3.恒温箱；4.连续进样器；5.涡旋仪；6.96孔微孔板；7.离心管；8.研钵或匀浆器；9.试管。（三）试剂1.洗涤缓冲液：0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液（PBS），含0.05％Tween-0；2.RAMIG溶液，或“激素-蛋白”复合物；3.0.1％封闭蛋白（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）；4.抗激素Mab，或Pab；5.激素标准品母液，及参比系列溶液（按双倍或四倍系列稀释）；6.HRP标记激素，或HRP-GARIG；7.邻苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/LpH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。三、实验步骤固相抗体型elisa。1.用方阵法滴定选择各反应物Z适工作浓度；2.将100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔，4℃湿盒，12h；3.弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；4.加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；