从母乳到配方奶粉，核苷酸的作用不可替代！婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的检测

目前，婴幼儿配方奶粉中核苷酸的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱质谱法，前处理采用沉淀蛋白结合固相萃取净化。GB 5413.40-2016等只沉淀蛋白质，未进行有效净化，可能导致杂质对UMP或GMP的干扰；HLB小柱杂质去除能力弱，单一的阴离子交换固相萃取柱净化外标法造成回收率偏低，需要合适的内标进行回收率校正；液相色谱-质谱联用由于基质效应和磷酸官能团的影响，造成定量不准确。

检测方法及优势

本方法采用二维固相萃取净化结合液相色谱紫外检测器联用，用ProElut Nucleotide(Cat.#: 65943)乳粉中核苷酸检测专用柱净化，用Spursil C18(250x4.6mm，5μm)(Cat.#: 82006)对婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸进行定量测定，有效地消除了杂质干扰，准确度高，为婴幼儿配方奶粉中核苷酸的定量测定提供参考依据。

1、实验方法

1.1

提取

称取1g±0.005g样品于50mL聚丙烯离心管中, 加入 20mL纯水, 涡旋混合3min, 用10%乙酸水溶液调 pH到4.1, 8000r/min 高速离心3min, 将全部提取液转移至25mL容量瓶里, 用一级纯水定容至刻度线, 摇匀，待净化。

1.2

净化

取2.5mL净化液加入ProElut Nucleotide(Cat.#: 65943)乳粉中核苷酸检测专用柱(预先用3mL甲醇和3mL纯水活化), 依次加入5mL 1%乙酸水溶液和5mL甲醇清洗, 弃去清洗液, 加入8mL 30%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 将洗脱液在50℃减压蒸干, 准确加入1mL流动相超声溶解, 过0.22μm 水溶性滤膜, 待液相测定。

1.3

色谱条件

色谱柱: Spursil C18(250x4.6mm，5μm)(Cat.#: 82006);

进样量: 20μL

柱温: 40℃

流速: 1.0mL/min

流动相: 磷酸盐缓冲液(准确称取1.360g磷酸二氢钾和0.4753g四丁基硫酸氢铵, 加水溶解后, 定容到 1000mL):甲醇=96:4 (V:V)

检测波长: 254nm

2、结果与分析

2.1

提取条件的优化

采用乙酸溶液调pH沉淀蛋白, 通过调节不同pH的比较, 发现pH在4.1±0.05时沉淀效果最好, 于是选择将pH调节到4.1作为沉淀蛋白质最佳条件。

2.2

净化方法的优化

奶粉基质比较复杂, 采用C18和HLB净化效果均不理想。实验发现, 混合强阳离子固相萃取小柱对CMP和UMP保留较好; 混合弱阴离子固相萃取小柱对GMP、IMP、AMP 保留较好, 于是本研究将2种固相萃取模式结合起来, 采用复合模式ProElut Nucleotide(Cat.#: 65943)乳粉中核苷酸检测专用柱进行净化。

2.3

液相条件的优化

核苷酸是一类具有较强的极性和水溶性化合物, 迪马 Spursil C18(250x4.6mm，5μm)(Cat.#: 82006)是一款碳载量较低、耐高比例水相的色谱柱, 适合于极性较强的物质的分离, 通过实验发现该色谱柱对5种核苷酸有较好的分离保留。图1~3分别为标准溶液、样品、添加回收的色谱峰。

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