大分子药物生物分析中的主要应用技术

生物大分子药物目前主要包括治 疗性蛋白药物与核酸药物等，随着生物技术的迅速发展，生物大分子已被普遍用以治 疗肿瘤、本身免疫系统疾病和遗传代谢病等多种疾病。生物治 疗药物在临床和商业上的成功引起了行业内对其开发的日益重视，需要高质量的生物分析来支持这些药物的开发。

与常规药物一样，评估大分子药物的安全性和有效性需要彻底了解其药代动力学（PK）、药效学（PD）、毒代动力学（TK）以及免疫原性等特征。在药物与机体相互作用中，PK是研究机体对药物的处置作用，而PD和TK是分别研究药物对机体有益/有害的效应。PD/PK和PK/TK的相互关系是药物药理学评价的核心。FDA、NMPA等监管机构要求药物进入临床前必须证明其有效性和安全性，临床前和临床研究均需要研究药物的PK，同时FDA建议对免疫原性风险检测最 好在IND阶段和临床I期开展。因此，建立好的PD/PK/TK等生物分析方案对于大分子药物的临床前及临床分析评价极为重要。

与小分子药物相比，大分子药物具有分子量大、结构复杂、细胞外基质不容易透过、使用量低、身体易溶解等特性，其生物分析充满挑战。

生物大分子药物与传统小分子药物的药代动力学

特征比较（药学进展 ，2018年8期 ）

传统的生物分析方法通常依赖于基于小分子检测的液质联用系统和基于生物制剂的配体结合分析（ligand-binding assay，LBA)），目前这两种方法也用于抗体等生物药的生物分析中。在现在的创新药物中，还有mRNA、病毒载体、细胞治 疗产品等，这些药物本质上并非蛋白质药物，因此qPCR、流式细胞术、成像技术等手段也越来越多地用于生物药的生物分析中。

01、基于配体结合分析

生物分析中基于配体结合分析LBA是一种常用的分析工具，用于根据与其他生物分子的相互结合作用（binding interaction），定量测定生物分子（目标分析物，Analyte）在生物体液中的浓度，主要包括酶联免疫(ELISA)等。

目前ELISA是生物制药行业使用最广泛的配体结合式（LBA）检测平台，它一直以来都是蛋白质定量分析最常用的技术，现在大多数生物标志物的商业检测试剂盒都是基于ELISA的。这项技术对于某些临床前生物分析的应用仍然很有吸引力，比如血清单克隆抗体的PK。但是ELISA操作复杂、测试运行时间长，采用自动化平台可缩短分析人员操作的时间， 提高工作效率。

丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特的Biomek i7自动化工作站结合美谷分子仪器的SpectraMax i3 多功能酶标仪，可以自动化地对样本进行高通量的ELISA操作，大大避免实验误差及重复的人工劳动。

自动化工作站进行ELISA实验流程

自动化工作站进行ELISA实验的结果

02、液相色谱串联质谱检测系统LC-MS/MS

与LBA 相比，LC-MS/MS 在生物分析中的优势在于可以提供快速的方法开发和验证、高特异性和高重现性，还可以实现多种分析物同时定量。另外，LC-MS/MS 方法也更容易在不同的分析物类别和基质之间转移。但是灵敏度、样品制备、方法开发和定量准确度相关的难题也亟需解决。

丹纳赫生命科学旗下SCIEX开发了一种通用的混合LBA和LC-MS/MS两种技术的工作流程，该工作流程结合了这两种技术的优势，可用于蛋白质药物的PK分析。该方法检测阿达木单抗在小鼠血浆中的浓度，先用磁珠方法进行免疫亲和性样品的制备，然后将阿巴利单抗标准品进行消化后进入TripleTOF™ MS系统进行肽图谱分析，用以选择蛋白质定量的特征性肽段。在QTRAP 6500+系统进行定量分析后，50 到 10000 ng/mL 的线性关系可达0.99763，定量限为50 ng/mL。

LC-MS/MS方法的前处理流程

阿达木单抗的提取离子色谱图   

SCIEX QTRAP™ 6500+ 系统

03、qPCR技术

qPCR法是常用的分析核酸药物表达量的一种方法，其定量下限可以达到pg/mL甚至fg/mL，这可以极大增强药物在体内暴露的检测时间。此外，RT-qPCR使用的样本量极少，只需要几微升血浆样本或1毫克组织即可满足分析需求，减少了对珍贵样本的使用，而且能够使用384孔板实现对样本的高通量分析。然而获得信号特异、低背景的qPCR结果也非易事，丹纳赫生命科学旗下IDT埃德特的双淬灭荧光探针，在靠近报告基团9bp左右的位置增加一个中间淬灭基团，为FRET作用中提供了一个能量的“中转站”，拉近了能量传递中每个基团间的距离，从而提高了荧光淬灭率降低了背景信号。

IDT 双淬灭荧光探针示意图

（蓝色序列片段即为双淬灭荧光探针）

在过去20年中，新型治 疗方式的出现改变了生物分析领域的现状，导致了一系列技术的发展和成熟。在发现阶段以及药物开发的临床前和临床阶段，健全的生物分析方法非常重要，这将有助于开发更安全、更有效的药物，同时减少开发的时间和成本。丹纳赫生命科学一系列先进的生物分析工具和方法能够有效帮助应对创新药物复杂结构和不同作用机制对PK、PD和免疫原性评估提出的重大挑战。

 在高效液相色谱应用的初期，人们认为它会成为气相色谱的补充方法，然而今天HPLC在药物分析中几乎完全取代了气相色谱。与其他方法相比，在色谱过程中可能会改变流动极性的液体流动相的应用以及根据所测试物质的特性对流动相进行的所有其他修改，在分离过程中具有很大的优势。

       任何药物的高效液相色谱 (HPLC) 分析的目的是确认药物的特性并提供定量结果。还可以用于通过药物注册前调查期间的生物医学和治疗研究，进一步了解人体的正常和疾病过程。生物体液（尤其是血浆、血清或尿液）中药物和代谢物的分析是高效液相色谱最苛刻但最常见的用途之一。血液、血浆或血清含有十种浓度远高于分析物浓度的大量内源性化合物。分析物浓度通常很低，对于药物而言，内源性化合物有时在结构上与待测药物非常相似。药物与血浆蛋白的结合也可能发生，这会减少所测量的游离化合物的量。

       液相色谱技术对于研究小分子和大分子之间的相互作用非常方便，特别是研究药物-蛋白质结合。部分研发人员已经使用固定化人血清白蛋白相来研究苯二氮卓类药物、华法林、布洛芬等药物的相互作用。使用这个阶段作为体内发生的相互作用的模型可以更进一步。通过在流动相中添加药物，可以研究一种药物与人血清白蛋白的相互作用如何受到另一种药物的影响。

       液相色谱还广泛用于对药物制剂进行的药物溶出度研究，以评估进入胃时制剂中药物物质的可用性。将制剂搅拌，溶解浴通常含有旨在模拟胃中条件的水性缓冲液，然后在设定的时间段内对水性缓冲液取样并分析药物浓度。药物稳定性研究至关重要，因为需要避免潜在的有毒降解产物。在此类研究中，有必要证明制剂的药物含量没有随时间变化。此外，如果确实发生降解，则有必要识别和量化降解产物。现阶段在很多国家的药典中都是使用高效液相色谱法代替化学和许多仪器方法来控制药物。

      深圳市恒谱生科学仪器有限公司是致力于高品质色谱耗材配件的研发制造OEM为一体的生产企业，专业研发色谱柱、空柱管总成、保护柱、在线过滤器、筛板、溶剂过滤器、管路接头等。 我们不断地提高研发制备能力、优化管理体系,以严苛的制程管控、优质的产品服务，为各色谱仪器厂家和耗材供应商提供更优质的产品及更有力的服务支持，与大家携手共创美好未来!

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