分析型超速离心（AUC）文献快报-5月刊

Control and Characterization of the Compactness of Single-Chain Nanoparticles

单链纳米颗粒聚合物紧实度的控制与表征

发表日期：December, 2021

DOI：0.1021/acs.macromol.1c02071

摘要：

高分子化合物自我交联形成单链纳米颗粒聚合物时与蛋白质的折叠有一些相似之处;然而, 蛋白质有清晰的能量构象，可以精确地决定其折叠结构，而单链聚合物纳米颗粒 (SCNPs)有很多无法确定的结构。有一些研究结果表明，SCNPs的一些结构参数可以被控制，例如紧实度。本研究中，我们在溶剂中以聚烯 丙胺(Mw ~ 22 000 Da)与二羧酸 (HOOC−R−COOH)单体来构建 SCNPs，初始链采用扩展构象或紧缩构象。我们使用的间隔基团R组是−CH2CH2−，−(CH2S)2−，或−(CH2CH2)3−，其长度大概在~ 4到~ 12 Å之间变化。我们使用了不同的表征方式，例如 1H 磁共振扩散有序光谱(DOSY)， 粘度仪，分析型超速离心机，和1H 磁共振 T2弛豫，系统性的研究了初始反应条件和交联分子的长度下SCNPs紧实度的变化情况。总结来说，当使用短的交联分子时， 长度较短的环状结构占主导地位，交联过程无法实现大规模的压缩，导致SCNPs不太紧实。而当SCNPs被预折叠后(0.1 M NaCl溶液或10 vol %乙醇溶液)，产生的颗粒紧实度要高得多。更重要的是，我们发现化学性质基本相同的SCNPs与HeLa细胞相互作用时，其毒性却不同，越致密的毒性越小。交联后更加紧凑。

目的：对单链聚合物纳米颗粒的沉降系数，摩擦系数进行表征。

仪器型号：Optima XL-A, An-60 Ti 转子

SCNPs的沉降系数与摩擦系数比等高线图。每个等高线图代表一个不同条件下被合成的SCNPs。所有上样浓度都是固定的，并对峰图进行了归一化处理较。虚线表示f/ f0的平均值。

AUC实验条件：

20℃，60000转/分(径向步进0.003 cm)下，使用带石英窗的双扇形中心件，光程长度为1.2 cm，对0.5~1.0 OD的 SCNP溶液进行230 nm光吸收测量，使用50-100条扫描数据，在sedfit软件里用2D c(s, ff0)模型进行分析，对于无法确定的Vbar值，使用不同的Vbar值进行拟合，直到分子量接近理论的30 kDa。

REFERENCE

Dam, J.; Schuck, P. Calculating Sedimentation CoefficientDistributions by Direct Modeling of Sedimentation Velocity Concentration Profiles. In Methods in Enzymology; Numerical

Computer Methods, Part E; Academic Press, 2004; Vol. 384, pp 185−212.

Schuck, P. Analytical Ultracentrifugation Direct Boundary Modeling with Sedfit. http://www.analyticalultracentrifugation.com/ (accessed June 25, 2021).

Brown, P. H.; Schuck, P. Macromolecular Size-and-Shape Distributions by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation. Biophys. J. 2006, 90, 4651−4661.

Schuck, P.; Perugini, M. A.; Gonzales, N. R.; Howlett, G. J.; Schubert, D. Size-Distribution Analysis of Proteins by Analytical Ultracentrifugation: Strategies and Application to Model Systems. Biophys. J. 2002, 82, 1096−1111.

AAV analysis by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: beyond empty and full capsids

通过沉降速率分析超速离心法分析AAV：不仅仅是空衣壳(empty)和全衣壳(full)

发表日期：2023 Apr 10

DOI:10.1007/s00249-023-01641-4

摘要：

最近对用于靶向DNA递送的重组腺相关病毒 (AAV) 载体的治 疗兴趣激增，使分析超速离心 (AUC)成为人们关注的焦点。AAV治 疗药物生产过程中的一个主要问题是活性物质（含DNA 衣壳或“填充衣壳”）的纯度。将DNA装载入AAV并不是一个高效的过程；因此，可能存在大量空的和部分/中间AAV载体。FDA最近的指导意见包括应限制空AAV衣壳和其他杂质的存在，以降低免疫毒性。虽然色谱技术（SEC、SEC–MALS、AEX）被大多数生物化学家所熟知，也常用于空衣壳和全衣壳定量，但在原始制剂缓冲液中进行沉降速率(SV-AUC) 实验，SV-AUC其所获得的分辨率和灵敏度是无与伦比的。其他人已经讨论了使用SV-AUC确定空衣壳比的方法；然而，在本报告中，我们重 点关注表征其他杂质的重要性，例如游离DNA、部分填充的衣壳和被认为具有免疫毒性的聚集体。我们还展示了应用多重分析（例如，c(s)、g(s*)、WDA）在确认这些不同物质的流体动力学参数的存在和确定方面的有用性。

型号：Beckman Coulter Optima AUC分析超速离心机

(A) 双组分系统（空衣壳和全衣壳）的SV-AUC 实时数据。

 (B) 多组分AAV 样本的实时SV-AUC 数据（LOC : DNA、破损的衣壳和其他沉降较慢的物质、empty: 空衣壳, partial genomes: 部分基因组包装的衣壳，full capsid：完整衣壳, HOC：过度包装的衣壳和聚集体）

Bibliography

Yarawsky AE, Zai-Rose V, Cunningham HM, Burgner JW 2nd, DeLion MT, Paul LN. AAV analysis by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: beyond empty and full capsids. Eur Biophys J. 2023 Apr 10. doi: 10.1007/s00249-023-01646-z. Epub ahead of print. PMID: 37037926.

Comparative sedimentation equilibrium analysis of two IgG1 glycoforms: IgGCri and IgGWid

IgGCri 和IgGWid两种 IgG1 糖型的沉降数据分析对比

发表日期：14 March 2023

DOI:https://doi.org/10.1007/s00249-023-01656-x

摘要：

通常，蛋白质在体内的自然“衰老”是由氨基酸侧链结构的变化引起的，例如蛋氨酸的氧化。当从血液/血清/血浆中纯化任何蛋白质或离体（即从细胞培养S上清液）产生的重组蛋白时，这种自然结构变化可能会被放大。众所周知，生物制药行业受到此类问题的困扰：在开发可能的mAb疗法时，任何在互补决定区（CDR）内具有敏感性氨基酸的候选药物都会被剔除。

自具有自动数据采集和分析程序的新一代商用分析超速离心机问世以来的30 年中，与SV（沉降速率法）方法相比，SE（沉降平衡法）技术似乎有所落后。本文使用AUC中的SE与SV的组合，表征IgG中的糖基化系统，采用SEDFIT-MSTAR和MULTISIG两种互补分析程序，分析两种不同IgG1糖型的特性。

目的：

IgGCri在其Fc结构域上具有双触角复合型聚糖，其完全糖基化和部分酸化，而在IgGWid上，它们是非糖基化，部分半乳糖基化和非酸化。尽管存在这些差异，SEDFIT-MSTAR分析显示IgGCri的~（150±5）kDa和IgGWid的~（154±5）kDa的重均摩尔质量Mw相似，并且两种糖型都显示出存在一小部分二聚体，这些二聚体通过MULTISIG分析以及SV沉降系数分布表明，不同浓度下两种糖型的主峰沉降系数~6.4S，SE,SV的数据接近性表明，不同糖基化特性对溶液中的摩尔质量（分子量）和构象没有显著影响。

型号：Beckman XL-I

实验数据：

图1.  SEDFIT-MSTAR输出显示IgG1Cri和IgG1Wid的点或局部表观重平均摩尔质量Mw（r）（负载浓度为0.5mg / mL时）作为径向位置r的函数

图2. IgG1Cri和IgG1Wid在0.5和1.0 mg/mL上样浓度下C（s）与IgG1Wid的沉降系数分布。c（s）轴已针对不同的负载浓度进行了归一化。

实验结果：

尽管是不同的IgG1糖型，SEDFITMSTAR分析显示IgGCri的~（150±5）kDa和IgGWid的~（154±5）kDa的平均摩尔质量Mw相似，并且两者都显示了一小部分二聚体存在的证据。SEDFIT的SE和SV沉降系数分布接近，两种糖型在不同浓度下的主峰沉降系数预测值为~6.4S，表明不同糖基化特性对溶液中的摩尔质量和构象没有显着影响，至少对于这对IgG1抗体而言。

较高摩尔质量成分（IgG1Cri为~8.5S，IgG1Wid为~9.5S）的不同沉降系数，如果对应于二聚体，可能对应于不同的构象。为了进一步分析这一点，需要与其他流体动力学和X射线散射技术相结合。

AUC实验条件：

• SE：采用12 mm环氧树脂双扇区中心件，铝制外壳，蓝宝石窗口， 0.5 mg/mL上样浓度，Buffer 100 μL, 离心条件20.0 °C，12，000 rpm，使用SEDFIT-MSTAR生成平均摩尔质量Mw。

• SV：采用12 mm环氧树脂双扇区中心件，蓝宝石窗口， 每种免疫球蛋白的上样浓度为0.5和1.0 mg/ml ，Buffer 400 μL, 离心条件20.0°C转速为49，000 rpm。使用SEDFIT进行分析, 给出沉降系数c（s）与s的表观分布，以及相应的（表观）平均沉降系数。分辨率设置为250，置信区间0.95。

REFERENCE

Hammad, K. A., Dinu, V., MacCalman, T. E., Pattem, J., Goodall, M., Gillis, R. B., ... & Harding, S. E. (2023). Comparative sedimentation equilibrium analysis of two IgG1 glycoforms: IgGCri and IgGWid. European Biophysics Journal, 1-5.