分析型超速离心（AUC）文献快报-2月刊

Development of a SARS-CoV-2 Vaccine Candidate Using Plant-Based Manufacturing and a Tobacco Mosaic Virus-like Nano-Particle

使用基于植物制造和烟草花叶病毒样纳米颗粒开发SARS-CoV-2候选疫苗

发表日期：17 November 2021

DOI：https://doi.org/10.3390/vaccines9111347

摘要：

稳定、有效、易于制造的疫苗对于阻止由冠状病毒 SARS-CoV-2 引起的 COVID-19 大流行至关重要。我们构建了一种候选疫苗 CoV-RBD121-NP，它由刺突糖蛋白 (S) 的 SARS-CoV-2 受体结合域 (RBD) 与人 IgG1 Fc 域 (CoV-RBD121) 融合并结合到改良的烟草花叶病毒 (TMV) 纳米颗粒上。在体外，CoV-RBD121与宿主病毒受体ACE2和单克隆抗体 CR3022 结合，CR3022 是一种阻断S与 ACE2 结合的中和抗体。CoV-RBD121-NP候选疫苗保留了关键的SARS-CoV-2刺突蛋白表位，具有一致的安全性、一致性和强度，并且在 2–8°C 或 22–28°C下储存 12 个月时显示出稳定的效力。免疫原性研究表明，在使用非佐剂或佐剂 (7909 CpG)后，C57BL/6小鼠产生了强烈的抗体反应。非佐剂疫苗诱导了平衡的 Th1/Th2 反应和识别 SARS2-CoV-2 的 S1 结构域和完整 S 蛋白的抗体，而佐剂疫苗诱导了 Th1 偏向反应。佐剂和非佐剂疫苗均诱导病毒中和滴度，如通过三种不同的测定法所测量的。总的来说，这些数据表明，通过 SARS-CoV-2 RBD 与 TMV 样纳米颗粒的结合，可以生产稳定的 COVID-19 候选疫苗。

仪器型号：ProteomeLab XL-A 分析超速离心机、AN-50Ti转子

CoV-RBD121-NP 的物理特性

(A)TMV Ntk病毒体和CoV-RBD121-NP（与抗原结合后的病毒体）的透射电子显微镜结果。黄色箭头表示结合抗原的位置）。比例尺 = 200 纳米。

(B) CoV-RBD121-NP 在释放时以及在 2–8 °C下储存后1个月和3个月的大小分布。根据分析超速离心(AUC)后的曲线下面积计算分布。

AUC实验条件：

将 TMV NtK 和结合疫苗稀释至目标浓度，并使用光程为12 mm的2通道树脂中心件，将样品加载到样品池中。
加载的样品池被放置在AN-50Ti转子中，并在Beckman-Coulter ProteomeLab XL-A 分析超速离心机中以 9000rpm 的速度分离。
每 4 分钟记录一次扫描，持续4 小时（每个样本 60 次扫描）。
数据使用 SEDFIT (vs. 11.3) 软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）进行分析。
勾选f/f0 值拟合，以找到每个样本数据最适合的拟合结果。
使用的置信区间为0.683，勾选拟合time-invariant noise。
使用 OriginLab Origin vs. 9.0.0（OriginLab, Northampton, MA, USA）绘制所得尺寸分布图，并对峰积分。

REFERENCE

Royal JM, Simpson CA, McCormick AA, Phillips A, Hume S, Morton J, Shepherd J, Oh Y, Swope K, DeBeauchamp JL, Webby RJ, Cross RW, Borisevich V, Geisbert TW, Demarco JK, Bratcher B, Haydon H, Pogue GP. Development of a SARS-CoV-2 Vaccine Candidate Using Plant-Based Manufacturing and a Tobacco Mosaic Virus-like Nano-Particle. Vaccines (Basel). 2021 Nov 17;9(11):1347.

Subunit Flexibility of Multimeric von Willebrand Factor/Factor VIII Complexes

多聚血管性血友病因子/因子VIII复合物的亚基柔韧性

作者：Ernest T. Parker, Sandra L. Haberichter, and Pete Lollar

发表日期：25 August 2022

DOI: https://doi.org/10.1021/acsomega.2c03389

摘要：

血管性血友病因子(VWF)是一种参与血小板粘附和聚集的血浆糖蛋白，是凝血因子VIII (blood coagulation factor VIII, fVIII)的载体。血浆VWF由多聚体组成，分子量从~ 0.55 MDa到10 MDa以上。VWF多聚物由一个可变数量的二硫连接~ 275 kDa的子基组成。本文在pH为7.4的条件下，用色谱法对血浆源性人VWF/fVIII配合物进行分离，并对其进行凝胶电泳、沉降速率法分析超离心(SV AUC)、动态光散射(DLS)和多角度光散射(MALS)检测。本研究结果与非流动条件下VWF多聚物模型的结果一致，在非流动条件下，多聚物具有显著的灵活性。对于同源系列聚合物，如VWF多聚体的分布，分子质量与回转半径、沉降系数或用扩散系数作为大分子的诊断指标构象。

目的：表征VWF多聚物

型号：Beckman−Coulter XLI

实验条件：20°C，上样量400uL, 吸光度280nm, 使用sedfit进行分析，置信区间设置0.68

实验结果：

图1：sepacryl S-1000 VWF/FVIII样品, 280 nm处从左到右的吸光度扫描原始数据

图2：c(s) 模型拟合后得数据，样品1 (蓝色), 9 (绿色), 13 (红色)

图3：VWF/fVIII Complexes 的SV AUC数据汇总

Bibliography

Parker, E.T., Heritier, S.L. and Lollar, P., 2022. Subunit flexibility of multimeric von Willebrand factor/factor VIII complexes. ACS omega, 7(35), pp.31183-31196.

SV-AUC as a stability-indicating method for the characterization of mRNA-LNPs

SV-AUC作为一种表征mRNA-LNPs稳定性的可行方法

发表日期：14 November 2022

DOI:doi.org/10.1016/j.ejpb.2022.11.014

摘要：

在SARS-CoV2大流行期间，以包裹mRNA的脂质纳米颗粒(LNPs)形式生产的mRNA疫苗，开创了一个新的疫苗领域。对于LNPs大小和结构变化进行定量分析是至关重要的，因为这些参数的变化可能对疫苗的效价产生影响。本项研究中，我们使用分析超离心机，以沉降速度 (SV-AUC)的方法对mRNA-LNP疫苗在相关应激因素(冻融、热、机械应力等)作用下的结构变化进行了稳定性定量分析，同时对比了DLS的相关数据。DLS能够准确的对mRNA-LNPs的大小和均一性进行表征。在压力因素下，如冻融和机械应力的作用下，DLS和SV-AUC都能检测到颗粒粒径和大颗粒物含量的增加。而50℃热应力的变化仅通过SV-AUC浮选的速率的变化被检测到。此外，SV-AUC可以观察到颗粒密度的变化，这是DLS无法检测到的。总之，SV-AUC是一种很有价值的mRNA-LNPs稳定性定量表征方法。

目的：表征mRNA-LNPs的应激稳定性

仪器型号：Optima AUC，AN-50 Ti转子

SV-AUC对mRNA-LNPs进行表征数据

不同应激条件下，通过SV-AUC对主峰和高分子量峰1进行量化。

实验条件：

20℃下，将样品和buffer溶液放入带蓝宝石窗口的双区中心件，在AN 50-Ti 转子上以每分钟 10,000 转下进行离心，检测260 nm and 280 nm吸收峰，检测间隔120 s，检测间隔10 μm。

使用UltraScan III对前95条数据进行分析，使用2DSA模型，对时间和径向噪音进行拟合。在最终的拟合计算中，使用CSA-SL-MC模型，选择范围：1 S到 200 S (主峰), 200 S到1200 S(高分子量峰1) ，1200 S到2000 S (高分子量峰2)。通过计算得到加权平均沉降系数和摩擦系数比(f/f0)，以及相对含量。

REFERENCE

E. Brookes, W. Cao, B. Demeler, A two-dimensional spectrum analysis for sedimentation velocity experiments of mixtures with heterogeneity in molecular weight and shape, Eur. Biophys. J. 39 (3) (2010) 405–414.