应用分享︱采用TSKgel G6000PWXL尺寸排阻色谱柱测定葛仙米水溶性多糖含量

葛仙米属于蓝藻门念珠藻科，是一种具有较高经济价值的可食用蓝藻。葛仙米多糖是由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等多种单糖组成，具有抗肿瘤、抗凝血与抗 菌等作用。研究表明葛仙米多糖主要为大分子量多糖，且该多糖部分没有蛋白和核酸的吸收，可采用HPLC-RI方法进行定量分析。

本次分享的应用中，作者采用TSKgel G6000PWXL尺寸排阻色谱柱及示差折光检测器 (RI) 检测建立了一套高效液相色谱快速、准确直接测定葛仙米中大分子量多糖含量的方法。

01 分析条件

色谱柱：TSKgel G6000PWXL（7.8 mmI.D.×30 cm, 13 μm）

流动相：0.05 M 磷酸二氢钠+0.15 M硝酸钠（pH 7.0）

流速：0.5 mL/min

进样体积：100 μL

柱温：30 ℃

检测器：RI

02 测定方法

将经过预处理的葛仙米多糖提取液按标准溶液的测定条件测出峰面积。根据线性方程和以下公式算出葛仙米多糖的含量。多糖含量=D/M×100%，其中，D为根据线性方程算出葛仙米多糖的质量体积比（mg/mL），M是原料质量体积比（mg/mL）。

03 分析结果

图1  标准品和样品对比色谱图

图2  纯水和样品紫外280nm检测下对比谱图

04 结果与讨论

以醇沉的葛仙米多糖为标准品，在0.015625-5.0 mg/mL内，峰面积与进样量作标准曲线得到线性方程Y=1995695.548X-170.597，峰面积与样品浓度，线性关系良好（R2=0.999）,定量上限为10 mg/mL、下限为0.078625 mg/mL。

HPLC法测定葛仙米多糖与苯酚硫酸法相比，优势在于可以测定特定分子量范围的多糖。采用TSKgel G6000PWXL尺寸排阻色谱柱，能够在大分子多糖无蛋白和核酸干扰的情况下更加准确地进行定量。

参考资料：

1. 苏攀峰, 唐庆九, 陈盛 等. 高效液相色谱法测定葛仙米水溶性多糖含量. 上海农业学报. 2020, 36 (1):105-110

GX液相色谱柱是消耗品，会随着使用时间或进样次数的增加，出现柱效下降无法达到分离要求，或伴有峰型拖尾、分叉等情况。需要定期进行清洗和再生，以保证色谱柱的柱效和使用寿命。

不同类型的色谱柱都有与之对应的清洗方法。本文为大家介绍TSKgel SW系列硅胶尺寸排阻色谱柱的清洗方法。

根据样品性质，建议先从以下①和②中选择适当的清洗方法，每一步清洗之间用纯水冲洗。清洗色谱柱时的流速与溶剂替换流速一致。

1 去除离子性杂质

使用高盐浓度的流动相（例如：0.5M硫酸钠，pH3溶液）或酸性水溶液（例如：磷酸盐缓冲液，pH2.5）过柱清洗。

2 去除疏水性杂质

在清洗液中添加10-20%的甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂过柱清洗。

如果采用上述两种方法清洗后色谱柱性能仍不能恢复，再考虑以下第③种方法。

3 去除难溶性蛋白质或其他物质

在清洗液中添加6-8mol/L的尿素或0.2-0.3%的中性表面活性剂（Triton、Tween、Brij等）后过柱清洗。但需要留意的是尿素或中性表面活性剂可能会残留在色谱柱上。

一般来说，清洗时间可选择为过柱5-10个柱体积便可。在吸附成分其吸附力极强时，即使进行过清洗，色谱柱性能也有可能得不到恢复。另外，请充分考虑清洗液的pH值，以避免损坏色谱柱。

甜菜碱（Betaine）是一种生物碱，天然存在于很多动植物体内。其分子内有3个有效甲基，作为甲基提供者参与合成蛋氨酸，在营养物质的代谢中起着十分重要的作用。甜菜碱在医药、化妆品、食品发酵和饲料工业等多个行业中都有广泛的应用。

本应用参照行业标准NY/T 2947-2016，按GX液相色谱法，采用亲水作用多孔硅胶色谱柱TSKgel Amide-80 (3 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm) 来测定甜菜碱的含量。分析结果表明，该色谱柱完全满足标准中对甜菜碱分离检测的要求。

溶液配制

样品稀释液：75% 乙腈-水溶液。

用样品稀释液将甜菜碱储备液 (2 mg/mL) 序列稀释得到浓度为0 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL的标准工作液，依次由低到高进样检测。

分析条件

色谱柱：TSKgel Amide-80 (3μm, 4.6mmI.D. ×15cm)

流动相：乙腈-水，梯度洗脱

流速：1.0 mL/min

柱温：30℃

紫外检测器：205 nm

进样量：10 μL

流动相梯度洗脱程序见下表：

分析结果

图1.  甜菜碱2000 μg/mL检测图谱

图2.  甜菜碱标准曲线（标准方差=0.99997）