四环冻干机—真空冷冻干燥特性参数测量与分析（二）

4.2冻干过程的分析与观察

4.2.1 低温显微镜

Hsu等将重组CD4-IgG(CD4-免疫球蛋白G)用四级串联的帕耳帖组件冷却至-60℃，用一架低温显微镜观察到了它的再结晶过程。他的观察室也可以被抽成真空而用于冷冻干燥研究。

Willemer将多次由低温显微镜获得的照片与电阻测量的结果进行了比较，低温显微镜的结构如图4-14所示。复杂产品的电阻测量有时很难解释清楚。图4-15所示的是某种病毒的低温保护溶液的电阻-温度曲线。冷却到-10℃，部分溶液冻结，然后过冷到约-46℃，在-65℃左右时溶液结晶。在溶液复温过程中，在-32.5℃左右时，电阻值变化迅速。用低温显微镜获得的照片显示出，在-40℃时，已被干燥和冷冻的两部分都呈现出均匀的组织结构（如图4-16）。而在-30℃时，这两部分都呈现出了黑色和灰色混合的区域，这表明，一些冰已经融化，并且扩散到了已干燥的部分。在这种情况下，通过改变CPA的浓度以及选择一个最佳的冷却速度，电阻测量可以认为是一种比较迅速的研究不同CPA的影响的方法。最终选择的浓度和冷却速度的组合可以用低温显微镜来测试。图4-17所示的是在冷冻、热处理过程中以及在干燥前，一种药品在低温显微镜下的结构变化。图4-17~图4-19所示的是来自同一实验中，同一样品的不同部分以及在不同的实验阶段的细节照片。

图4-17中，(a)是快速冷却过程中，约在-24℃时样品的照片，(b)是第一次从-54℃加热到约-36℃的照片，(c)是再次被冷却到-54℃时的照片。在图(a)中，大部分晶体（颜色较深处）均匀地分布在浓缩的非晶固体（颜色较亮处）中间。在图(b)中，晶体有所生长，浓缩物中的水分也已经结晶。在图（c）中，晶体与玻璃状杂质的边界清晰可见，特别是在图中右上角更明显。图4-18所示的是在一些具有可比性的温度下，样品另外的一个部分，即靠近样品边界的显微照片：(a)约在-23℃，(b)第一次加热时，约在-30℃，(c)再次冷却到-60℃。图(b)中，晶体已有所生长，但其大致结构没有太大的变化，特别是在图的左上角部分。在图(c)中，晶体与玻璃状物质的边界更加清晰。图4-18所示的是样品的第三部分：(a)冷却到一65℃之后的照片，(b)热处理后，再次冷却到-60℃，然后在-40℃开始冻干。同样，热处理并未使整体结构有所改变，但是晶体结构更加清晰，这表明玻璃相和晶体之间的水分子已经迁移到晶体中。图4-17~图4-19中的照片说明，快速冷却不能使整个样品的各个部分形成均匀的组织结构，因为它会受到边界效应的影响。但是，在样品的所有部分都观察到了热处理的影响。图4-20所示的是，从冷却结束温度（-60℃)上升到开始干燥温度（-42℃）时，不经热处理对晶体生长的影响。值得注意的是，在自动向低温搁板上装载产品时出现的现象。第一次装载药瓶中的产品与后来装载的，例如2~3h后装载的，产品有不同的结构。

低温显微镜研究的优点是有可以显示样品组织结构变化过程的照片，而且，冻结的产品可以在大多数的设备中被冷冻干燥。产品层很薄，因此可以被迅速冷冻。所以，产品在复温和干燥过程中所表现出的性状特征与快速冷冻过程的相一致。因为产品层很薄，故模拟热处理的过程很困难。然而，实验表明，从此项研究中获得的临界温度是有价值的，特别是获得冷冻速率相对缓慢时产品的电阻值。

Nunnerf使用一台特殊的低温显微镜拍摄到了0.9%的NaCl溶液在360s内直接冷冻到稳定树枝状冰晶结构的过程中冰晶边界面变化的照片（如图421）。在冰晶的表面可见因浓缩而集中起来的NaCI(黑色边界)。

Cosman等人描述了一台可以定量评价照片的低温显微镜，该装置有如下四个显著特点：

①温度的产生、测量和控制是由程序控制的;

②显微照片可以存档，以备后用；

③文档可部分地用于自动图像识别;

④如果冷冻过程可以用数学的方法描述，而且细胞的行为可以预测，则用上述方法可以减少数据量。

图4-22表示的低温显微镜系统的布置图。通过使用热传导性非常优良的蓝宝石观察窗和使用液氮冷却系统，作者实现了以每分钟几百度的冷却速率冷却到一60℃，而且在温度为0℃时，样品内的温度梯度达到了0.1℃/mm。

下面用三个例子来说明使用这种显微镜系统如何进行冷冻过程的定量研究和存档。图4-23表示的是被分离的老鼠胰岛细胞的体积与温度的函数关系曲线。如图4-24所示，细胞膜对水和CPA的渗透性的不同对细胞的冷冻是非常重要的。

将猕猴卵母细胞置入体积分数10%的二甲基亚砜溶液(DMSO)后其体积几乎减少到原来的三分之一，这是因为水能从细胞里扩散到周围环境中去，而二甲基亚砜却不能扩散到细胞内（测量温度为23℃）。

细胞损坏的原因在于细胞内冰晶成核。图4-25表示在不同冷却速率下，有多少老鼠卵母细胞内发现胞内冰与温度之间的函数关系曲线。老鼠肝细胞在以大约40℃/min的速率冷却到-21℃的过程中没有发现胞内冰，然而，当以140℃/min速率冷却时几乎所有的细胞内都存在冰，这是因为水没有足够的时间扩散到周围环境就被冻结在细胞内。图4-25也说明细胞内冰晶成核是由绝对温度和冷却速率决定的：在大约-25℃，以5℃/min速率冷却几乎所有的细胞内都有冰，然而，以3.5℃/min速率冷却，大约20%的细胞内没有冰。

Dawson和Hockley利用扫描电子显微镜(SEM)表明了海藻糖和甘露醇溶液的快速冷冻(150℃/min)和慢速冷冻(1℃/min)时结构上的差异。图4-26表示1%海藻糖溶液被(a)慢速和(b)快速冷冻时中心部位的表面结构。慢速冷冻样品（c）浓缩的固体表面上产生裂缝，然而，快速冷冻的样品的结构却是均匀的纤维状。图4-27表示慢速和快速冷冻1%乳糖时其中心部位粗糙的(a)和精细的(b)结构。在图4-28(a)中可发现海藻糖溶流崩塌的部分，图（b)表示干燥后产品在潮湿的环境下贮存6个月以后的结构，图片表明不同的冷冻速率导致不同的结构，且有可能使固体浓缩在表面上，在干操过程使干燥速率降低，残余水分含量增加。