Neuron：Piezo1可作为AD治疗靶点！厦大莫玮教授团队揭示小胶质细胞感知Aβ斑块新机制

文献精读第41期

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年人常见的神经系统变性疾病，患者会出现日渐加重的认知障碍，严重影响了生活质量。AD的病理特征主要包括存在于细胞外的淀粉样蛋白-β(Amyloid-β, Aβ)斑块，以及神经元内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结。小胶质细胞是定植于神经系统的固有免疫细胞，它可以通过物理或化学的手段来感知局部微环境的动态变化，来清除微环境中的损伤因子，从而对神经元起到保护作用。在AD中，小胶质细胞能够识别并吞噬病理性的Aβ聚合物和斑块沉积，因此对AD的靶点寻找和疾病治疗和具有重要价值。然而对于小胶质细胞是如何来感知并识别Aβ斑块的作用机制，目前的研究尚未完全阐明。

2022年11月10日，厦门大学生命科学学院莫玮教授团队在Neuron杂志上发表了题为“Microglial Piezo1 senses Aβ fibrils stiffness to restrict Alzheimer’s disease”的研究论文。该研究证实，小胶质细胞对不溶性Aβ纤维硬度的感知依赖于机械力受体Piezo1。在AD小鼠模型中，Piezo1缺失导致小鼠的Aβ病理和神经退行性病变的加剧。相反，通过药理学手段来激活Piezo1能够显著改善AD相关病理变化。该研究结果表明，小胶质细胞中的Piezo1可能是一个有前景的AD治疗靶点。

鉴于Aβ斑块的多种化学成分，之前的研究工作主要集中在小胶质细胞如何通过化学信号来感知Aβ斑块。最近的研究表明，小胶质细胞能够对机械力的变化做出反应，并优先迁移到更坚硬的基质上，而小胶质细胞对Aβ斑块硬度响应的机械感知尚不清楚。Piezo家族是哺乳动物细胞中的机械敏感性阳离子通道蛋白。作为机械力受体，Piezo可通过感受细胞膜机械力的变化，包括剪切应力、硬度和周期性压力等，并将机械信号转化为电信号或化学信号。

为了确定Aβ斑块在物理特性上的改变，文章作者利用原子力显微镜对在体标记的Aβ斑块进行了检测。结果表明，在鲜活脑片中，Aβ斑块组织的硬度显著高于非Aβ斑块组织。作者进一步分析发现，相对其他机械通道蛋白，Piezo1在小胶质细胞中的表达最高。并且在体外原代培养小胶质细胞中，小胶质细胞中Piezo1的表达受到不溶性Aβ纤维硬度刺激而增高。最后，作者通过钙成像和电生理实验证实了小胶质细胞对纤维化Aβ硬度的感知依赖于Piezo1。此外，作者通过对AD小鼠模型和临床尸检样本进行了检测，观察到Aβ斑块附近的小胶质细胞中Piezo1的表达显著上调。

图1.5×FAD小鼠与AD患者脑组织中小胶质细胞Piezo1的表达升高

为了进一步确定小胶质细胞中的Piezo1在Aβ病理中的作用，作者对小胶质细胞中的Piezo1进行了敲除。Piezo1缺失加重了5×FAD小鼠（AD小鼠模型）的Aβ斑块负担、突触丢失以及认知损害，而且还会损害小胶质细胞的吞噬活性，减少小胶质细胞向Aβ斑块的聚集，导致斑块被包裹的程度减少，斑块更加松散。与之相反，在5×FAD小鼠中，作者在利用激动剂激活Piezo1后，小胶质细胞在Aβ斑块周围的聚集以及对Aβ斑块的吞噬显著增加，并且小鼠的认知功能也得到明显改善。然而，当小胶质细胞中的Piezo1被敲除后，给予Piezo1激动剂不再具有改善Aβ相关病理的作用。这些结果表明，Piezo1介导的小胶质细胞激活对于抑/制Aβ相关病理以及认知功能改善至关重要。

图2.小胶质细胞Piezo1激活能够显著改善5×FAD小鼠的Aβ斑块负担和认知能力

综上，小胶质细胞可通过机械感觉离子通道Piezo1来感知Aβ纤维硬度，调节小胶质细胞对Aβ斑块的反应，从而阻止Aβ病理的扩散，凸显了小胶质细胞机械生物学在AD病理中的保护作用。此外，激活小胶质细胞中的Piezo1减轻了AD相关病理，进一步提高了调节Piezo1活性在AD治疗中的价值。从机械转导途径揭示小胶质细胞Piezo1在AD病理中的作用，将进一步拓展我们对AD发病机制的理解。

研究方法亮点

这项工作揭示了小胶质细胞通过机械力受体Piezo1感知纤维化Aβ硬度的作用机制。研究用到了脑立体定位注射、膜片钳记录、原代细胞培养、免疫组化以及细胞分子检测等实验技术。瑞沃德深耕生命科学研究领域20年，一直致力于为客户提供可信赖的解决方案和服务。在该研究中，研究人员采用了瑞沃德公司生产的脑立体定位注射系统，为实验的顺利开展提供了支持。此外，瑞沃德还可提供的该研究所涉及的电生理记录、原代细胞培养、免疫组化以及细胞分子检测等实验的完整解决方案。截至目前，瑞沃德产品及服务覆盖海内外100多个国家和地区，客户涵盖全/球700+医院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全/球科研人员发表SCI文章14500+，获得行业广泛认可。

论文原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.10.021

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文献精读第37期

阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease, AD）是一种最为常见的神经退行性疾病，患者表现为进行性的记忆和认知功能丧失。随着全/球人口老龄化的日益加剧，AD患者数量不断增加，但是到目前为止，临床上仍然缺乏能够有效治疗AD的药物或手段。越来越多的证据表明，AD具有代谢性疾病的多种特征。例如，AD患者伴有大脑糖代谢障碍，并且它的发生先于患者认知功能障碍几十年。然而，糖代谢异常在AD发病过程中的作用机制目前仍知之甚少。

2022年10月6日，厦门大学医学院神经科学研究所张杰教授团队在Nature Metabolism杂志上发表题为“Microglial hexokinase 2 deficiency increases ATP generation through lipid metabolism leading toβ-amyloid clearance”的研究论文。文章证实，己糖激酶2（Hexokinase2, HK2）通过调节小胶质细胞的能量代谢，在小胶质细胞清除病理性的Aβ聚合物和斑块沉积的过程中发挥了重要作用，提示HK2可能是AD治疗的一个关键作用靶点。厦门大学医学院神经科学研究所张杰教授为本论文的通讯作者，冷历歌副教授为本论文的第/一作者及共同通讯作者。

在AD中，小胶质细胞通过消耗三磷酸腺苷（ATP）来清除具有神经毒性的Aβ蛋白低聚物和斑块沉积，这个过程需要大量的ATP。己糖激酶（HK）是葡萄糖代谢途径中的第一个关键酶，能够将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-Phosphate, G-6-P），促进ATP的产生。HK包含四种亚型（HK1-4），其中HK2是胰岛素敏感组织（如心脏、骨骼肌、脂肪和大脑）中主要的亚型。然而，HK2对AD中小胶质细胞功能的作用尚不清楚。

在该研究中，作者首先检测了在哺乳动物大脑中存在的HK1-3的表达情况，发现HK2在AD患者和AD小鼠模型（5xFAD小鼠）的小胶质细胞中表达特异性增高。随后，作者构建了小胶质细胞HK2特异性敲除的小鼠，并与5xFAD小鼠杂交（CcKO-5xFAD），以观察小胶质细胞中HK2缺失对AD的影响。小胶质细胞中HK2缺失可以减少Aβ斑块，并拯救5xFAD小鼠的认知功能障碍。此外，作者进一步利用抑/制剂来抑/制HK2活性，包括氯尼达明和3-溴/丙/酮酸，其中，氯尼达明已用于临床上多种肿瘤的治/疗。通过抑/制HK2激酶活性，作者同样观察到5xFAD小鼠大脑中Aβ斑块减少，以及小鼠的认知缺陷减轻。

图1.小胶质细胞中HK2缺失能够减少Aβ斑块，并拯救5xFAD小鼠的认知功能障碍

小胶质细胞在斑块周围聚集被认为是吞噬清除病理性Aβ斑块沉积的一个关键过程。作者进一步的实验表明，抑制或敲除HK2能够促进小胶质细胞的迁移和吞噬能力，这种迁移和吞噬的过程都需要消耗能量。令人惊讶的是，药物抑制或基因缺失HK2会降低神经元或星形胶质细胞中ATP的产生，但是可以显著增加小胶质细胞中ATP的形成。这可能与大脑小胶质细胞独特的代谢模式有关，抑制HK2信号导致小胶质细胞内脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein Lipase, LPL）表达上调，从而触发脂肪酸代谢，迅速提升胞内的ATP水平。最后，作者发现，HK2的两种下游代谢物G-6-P和果糖-6-磷酸（Fructose-6-Phosphate, F-6-P）通过磷酸戊糖途径调节NADPH水平，能够逆转HK2缺乏引起的LPL的升高。

总之，该研究证明了HK2是AD发病过程中糖酵解改变和脂质代谢之间的关键环节。在HK2抑制或缺乏时，小胶质细胞中的ATP水平显著升高，但神经元或星形胶质细胞中并没有。这一发现首次证实，葡萄糖的低代谢可以增加小胶质细胞中ATP的生成。此外，抑制小胶质细胞HK2可有效促进AD小鼠Aβ斑块的吞噬，减轻认知障碍。这些结果表明，以HK2为靶点的基因或药物干预可能是AD治疗的一种新策略。

论文原文链接：

https://doi.org/10.1038/s42255-022-00643-4

团队PI简介

张杰，教授、博导，国家杰出青年科学基金、国家优秀青年科学基金、教育部新世纪优秀人才等获得者。长期从事重大脑疾病比如老年痴呆（AD）、抑郁症等的致病机理和药物开发研究。至今以第一作者或通讯作者发表论文30余篇。近5年张杰教授以通讯作者在国际知名学术期刊（Nature Neuroscience, Neuron, Biological Psychiatry, Cell Reports, PNAS, JNS, JBC，Clinical Cancer Research等）发表多篇论文。热忱欢迎优秀博士后加盟，同时欢迎优秀学子报考厦门大学医学院张杰教授课题组研究生。联系方式：jiezhang@xmu.edu.cn

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文献精读第25期

文章概述

对人来说，皮肤温度高于43℃会引起急性疼痛，长时间暴露于伤害性热刺激中会造成组织损伤，并破坏体温的动态平衡。脊髓背角神经元在处理和传递来自背根神经节（Dorsal Root Ganglion, DRG）痛觉传入纤维的感觉信号中起着关键作用，但是，伤害性热刺激信号在脊髓中的处理过程尚不清楚。2022年5月12日，美国凯斯西储大学医学院的研究人员在《Neuron》杂志上发表题为“A novel spinal neuron connection for heat sensation”的文章，该研究证实了由脊髓ErbB4+（ErbB4，一种表皮生长因子受体家族的酪氨酸激酶受体）神经元能够通过NRG1-ErbB4信号通路来调控机体对伤害性热刺激的感受，揭示了脊髓中一个新的伤害性热刺激感受的调控机制。

核心观点

1、脊髓ErbB4+神经元能够被伤害性热刺激所激活；

2、脊髓ErbB4+神经元受TRPV1+伤害感受器的单突触神经支配；

3、消融或抑制ErbB4+神经元会降低动物对伤害性热刺激的感受；

4、同时抑制脊髓中ErbB4+、SST+和CCK+神经元能够进一步降低伤害性热刺激的感受；

5、NRG1-ErbB4信号通路能够促进伤害性热刺激的感受和热痛过敏反应。

研究结果分析

1. 伤害性热刺激能够激活脊髓中ErbB4+兴奋性神经元

为了识别对伤害性热刺激产生反应的神经元，作者利用了EGFP表达依赖于内源性cFos启动子的cFos::shEGFP小鼠。当cFos::shEGFP小鼠受到伤害性热刺激（52℃热板）时，脊髓背角神经元中的shEGFP表达增加，大量的shEGFP+神经元位于脊髓背角表层（Ⅰ~Ⅱ层），这是伤害性感觉信息的接收区域。单细胞RT-PCR结果显示，78%的shEGFP+神经元为兴奋性神经元（Vglut2+），22%的shEGFP+神经元为GABA能神经元（GAD65/67+）。这与之前的研究结果一致，即大多数对伤害性热刺激产生反应的神经元是兴奋性神经元。然而，shEGFP+神经元具有极高的异质性，涉及到多种类型的神经元，比如，其中胆囊收缩素阳性（Cholecystokinin+, CCK+）和生长激素抑制素阳性（Somatostatin+, SST+）神经元分别占18%和14%。值得注意的是，~1/3的shEGFP+神经元表达了ErbB4，而ErbB4主要表达于兴奋性神经元中。

这些结果表明，伤害性热刺激能够激活一群ErbB4+兴奋性神经元。为了验证这一假设，作者对ErbB4:: CreER;Ai9小鼠进行热刺激，该小鼠tdTomato的表达依赖于内源性的ErbB4启动子。在脊髓中，ErbB4-tdT+神经元主要集中在背角，分布于多层背角和脊髓外侧核（Lateral Spinal Nucleus, LSN）中，然而，热激活的ErbB4-tdT神经元（cFos+）主要位于脊髓背角表层中。ErbB4-tdT神经元约占cFos+神经元33%。这些结果确认了脊髓背角表层ErbB4+兴奋性神经元是一种新型的伤害性热反应细胞。

2. 脊髓ErbB4+，SST+和CCK+神经元负责伤害性热刺激感受

接下来，作者通过在ErbB4::CreER;LSL-EYFP（ErbB4-EYFP）小鼠椎管内注射AAV-mCherry-DIO-dtA（AAV-dtA）病毒，在ErbB4+细胞中特异性的表达A型白喉毒素（diphtheria toxin subunit A, dtA）来消融脊髓中的ErbB4+神经元。与注射对照病毒的小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠中EYFP+细胞和Nmur2+神经元数目显著减少。接下来，小鼠接受了一系列的行为测试。与对照小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠在热板以及哈格里夫斯实验中，后爪退缩和舔爪的潜伏期中增加了~40%，表明ErbB4+神经元对伤害性热刺激的感受至关重要。辣椒素能够激活感觉神经元中的TRPV1受体，诱发自发性疼痛，与对照组相比，在AAV-dtA注射的ErbB4-EYFP小鼠，辣椒素诱导的小鼠舔足次数减少了30%。这些结果表明，ErbB4+神经元是伤害性热刺激的感受所必需的。此外，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠对机械刺激、冰冷-温热、以及痒刺激的反应与对照类似。这表明脊髓ErbB4+神经元可能不参与这些刺激的感受。

除了ErbB4+神经元，SST+和CCK+中间神经元也会被伤害性热刺激激活。为了确定它们对热刺激感受的贡献，作者分别消融了这些神经元。在热板以及哈格里夫斯实验中，消融SST+神经元后小鼠的反应潜伏期分别增加了26%和22%，而消融CCK+神经元的反应潜伏期则没有增加。值得注意的是，将ErbB4+、SST+和CCK+三类神经元同时消融时，小鼠对伤害性热刺激感受的抑制作用显著增加到60% - 80%。这些结果表明，伤害性热刺激感受涉及脊髓中的ErbB4+、SST+和CCK+神经元。

3. ErbB4+神经元受TRPV1+痛觉感受器的单突触神经支配，且能被伤害性热刺激而非机械刺激所激活

不同的躯体感觉信息由不同类型的传入纤维传入脊髓背角：Aβ纤维主要用于传递非伤害性刺激，而Aδ和C纤维用于传递伤害性刺激。为了确定ErbB4+神经元的信息来源，作者利用带背根的纵向脊髓切片来记录背角中ErbB4+神经元的兴奋性突触后电流（EPSCs）。对于Aδ和C纤维的刺激传入，分别有76%和54%的表层ErbB4+神经元记录到了EPSCs，其中67%和46%的ErbB4+神经元为单突触传入。相比之下，表层中有25%的ErbB4+神经元记录到Aβ纤维信息传入，只有9.1%是单突触传入。此外，在深层ErbB4+神经元中，6.7%和5.6%的神经元接受Aδ和C纤维的单突触传入。这些结果表明，浅表层的ErbB4+神经元主要接受携带伤害性信息的C和Aδ纤维的单突触传入。

为了验证ErbB4+神经元是否被TRPV1+伤害性感受器的突触支配，作者用到了QX-314（一种细胞内钠通道抑制剂，其细胞进入依赖于TRPV1的激活）。单独使用QX-314对C纤维传入的ErbB4+神经元EPSC振幅影响不大。然而，在TRPV1激活物辣椒素存在的情况下，QX-314使EPSCs减弱，表明ErbB4+神经元接受TRPV1+纤维的支配。与之一致的是，在QX-314和辣椒素的存在下，对C纤维刺激有反应的ErbB4+神经元的数量减少了。这种作用是C纤维特异性的，因为A纤维中TRPV1表达较低，QX-314对刺激A纤维产生的EPSCs的影响不大。这些结果为表层ErbB4+神经元受TRPV1+ C纤维的支配提供了药理学依据。为了找到这种神经支配的形态学证据，作者将AAV-DIO-mCherry注射到TRPV1::Cre;ErbB4::CreER小鼠脊髓腰膨大区标记ErbB4+神经元，并将AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到DRG中标记TRPV1+末端。脊髓切片用突触后标记物Homer进行染色标记。可以看到ErbB4+神经元（mCherry+）被TRPV1+末端（即EYFP+）包围。TRPV1+末端与Homer+突触以及ErbB4+细胞密切相关。这些结果进一步表明，脊髓背角表层ErbB4+神经元受到DRG中TRPV1+ 传入纤维的支配。

为了证明这些突触是有功能的，作者利用光遗传学激活表达视蛋白ChR2的TRPV1+末端。42%的表层ErbB4+神经元能够在光刺激下诱发EPSCs，这些EPSCs被TTX所抑制，而在TTX和4-AP同时存在的情况下，仍有36%的ErbB4+表层神经元能够被光刺激诱发EPSCs，这表明它们是由DRG中TRPV1+传入纤维的单突触所支配的。综上所述，脊髓背角表层ErbB4+神经元直接受TRPV1+伤害性感受器的单突触神经支配。

为了确定ErbB4+神经元是否对机械刺激产生反应，作者将AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到MrgprD::CreER;ErbB4::CreER小鼠DRG中，让传导机械刺激的MrgprD+神经元表达ChR2，同时将AAV-DIO-mCherry注射到腰膨大来标记ErbB4+神经元。然而，对脊髓切片进行光刺激，大多数的ErbB4+神经元（87%）未能记录到EPSCs，这表明大多数ErbB4+神经元不接受来自机械刺激感觉神经元的传入。在3个响应ErbB4+神经元中，有2个被TTX和4-AP抑制，表明它们接受了多级突触传导，只有一个出现了4-AP增强的EPSCs，表明其受到机械感觉神经元的单突触支配。作为对照，作者采用了相同的策略来观察SST+脊髓神经元对机械感觉神经元刺激的反应。大多数记录的SST+神经元（72%）产生了光刺激诱导的EPSCs，表明它们接受MrgprD+机械感觉神经元的传入，且61%为单突触支配。这些结果表明，脊髓背角表层ErbB4+神经元主要受伤害性热刺激感受神经元的支配，而非机械刺激感觉神经元的支配。

为了进一步表征在更接近生理条件下ErbB4+神经元的敏感性，作者构建了半完整的离体检测范式，通过分离相连的部分脊髓、腰椎根、DRG、隐神经和后肢皮肤，来记录脊髓ErbB4+神经元对皮肤刺激的反应。在记录的16个ErbB4+神经元中，有9个（56%）对52℃刺激有反应，有5个（30%）对0℃刺激有反应。对15℃和40℃刺激有反应的神经元分别为1个（7%）和2个（13%）。这些结果表明，表层ErbB4+神经元对伤害性热刺激的反应较好，其次是冰冷刺激，而对凉或温热刺激的反应较弱。为了确定ErbB4+神经元是否对机械刺激有反应，研究者用Von-Frey丝刺激皮肤。在16个记录的神经元中，有14个无反应。这些结果表明，脊髓背角表层ErbB4+神经元对伤害性热刺激比机械刺激更敏感。

4.抑制ErbB4+神经元会减弱动物对伤害性热刺激的感受，反之则增强动物对热刺激的感受

随后，作者探讨了脊髓ErbB4+神经元活性对伤害性热刺激感受的影响。为了降低ErbB4+神经元的活性，作者将AAV-DIO-hM4Di-mCherry（AAV-hM4Di）注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大，并通过CNO来抑制ErbB4+神经元活性。与对照相比，抑制ErbB4+神经元增加了小鼠在热板和哈格里夫斯实验中的反应潜伏期，并减少了辣椒素诱导的舔足。抑制SST+而非CCK+神经元，小鼠在热板以及哈格里夫斯实验中的反应潜伏期增加，但对辣椒素诱导的舔足没有影响。值得注意的是，当这三类的神经元活性同时降低时，小鼠对伤害性热刺激感受的抑制效果增加60%~80%。这些结果表明脊髓ErbB4+、SST+和CCK+神经元的活动共同参与伤害性热刺激感受，支持群体编码模式理论。

为了增加脊髓ErbB4+神经元的活性，作者将AAV-DIO-hM3Dq-mCherry注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大。与对照相比，激活ErbB4+神经元降低了小鼠在热板和哈格里夫斯实验中的反应潜伏期，且增加了辣椒素诱导的持续舔足时间。表明， ErbB4+神经元激活增强了动物对伤害性热刺激的感受。总之，这些结果揭示了ErbB4+神经元在伤害性热刺激感受中的关键作用。

5. 伤害性热刺激的感受依赖ErbB4激酶的活性

ErbB4由生长因子神经调节蛋白1（Neuregulin 1, NRG1）所激活，为了检测NRG1-ErbB4信号通路是否参与了伤害性热感受，作者检测了脊髓背角NRG1和pErbB4的表达。结果显示，暴露于52℃热板的小鼠其脊髓背角NRG1和pErbB4的表达增加，表明伤害性热刺激可以增强脊髓背角的NRG1-ErbB4信号。接下来，作者评估了 ErbB4的存在对伤害性热刺激的感受是否必要，为此，作者构建了ErbB4-rKO小鼠（该小鼠在除心脏外的任何组织，包括脊髓中都不表达ErbB4）。值得注意的是，与对照组小鼠相比，ErbB4-rKO小鼠在热板和哈格里夫斯实验中的反应潜伏期增加，且辣椒素诱导的舔足次数减少，表明ErbB4在这些反应中发挥了作用。随后，为了消除其它组织中ErbB4突变可能存在的影响，作者通过在ErbB4f/f小鼠脊髓腰膨大注射了AAV-Cre-GFP病毒，来特异性的敲除脊髓背角中的ErbB4。与对照组相比，脊髓背角ErbB4敲除使得小鼠在热板和哈格里夫斯实验中的反应潜伏期增加，辣椒素诱导的舔足次数减少。这些结果揭示了ErbB4在伤害性热刺激感受中的必要作用。

为了确定热感受是否涉及ErbB4的激酶活性激活，作者以鞘内注射的方式给小鼠注射阿法替尼（一种ErbB激酶抑制剂）。阿法替尼显著减少了脊髓腰膨大中pErbB4的表达。动物在热板、哈格里夫斯和辣椒素实验中的反应也减弱，但对针刺、掐和Von-Frey丝刺激反应的影响不大。这些结果提示ErbB4激酶活性与伤害性热刺激感受有关。为了进一步验证这一点，作者对敲入突变株的T796G小鼠进行了研究，在T796G小鼠中，ErbB4可以被体积较大的抑制剂1NMPP1特异性抑制。鞘内注射1NMPP1可降低脊髓腰膨大中pErbB4的表达。在行为反应测试中，1NMPP1显示了类似阿法替尼的效果。总之，这些结果表明脊髓中ErbB4的激酶活性与伤害性热刺激感受有关。

6. DRG中的NRG1参与了伤害性热刺激的感受

为了确定伤害性热刺激感受是否与内源性NRG1有关，小鼠被注射了ecto-ErbB4（一种NRG1中和肽）。鞘内注射ecto-ErbB4可减少脊髓中的pErbB4表达，并且增加小鼠在热板和哈格里夫斯实验中的反应潜伏期，减少辣椒素引起的舔足，但不会影响对针刺、掐和Von-Frey刺激的反应。这些结果表明，内源性NRG1参与了伤害性热刺激的感受。

NRG1在DRG中大量表达，为了确定DRG神经元中的NRG1是否参与热感觉，作者构建了advillin-CreER;NRG1f/f小鼠，通过给予他莫西芬，可以诱导小鼠感觉性神经节中NRG1的条件性敲除（cKO）。与对照相比，cKO小鼠脊髓中的NRG1和pErbB4蛋白的表达均减少，NRG1 mRNA的水平在DRG中降低，但在脊髓中没有显著变化。cKO小鼠在热板和哈格里夫斯实验中的反应潜伏期增加，在辣椒素实验中的舔足次数减少。然而，脊髓中的NRG1敲低对热刺激行为反应或背角中的pErbB4几乎没有影响。这些结果表明DRG中的NRG1信号在伤害性热刺激的感受中起作用。

7. NRG1-ErbB4信号能够调控ErbB4+神经元谷氨酸的传递

上述结果已经证明，表层中c-Fos+ ErbB4+神经元大部分是兴奋性神经元。为了确定NRG1和ErbB4是否能够调节谷氨酸的传递，作者将AAV-DIO-ChR2-EYFP病毒注射到ErbB4::CreER;Ai9小鼠中，在ErbB4+神经元中特异性表达ChR2。在脊髓切片中，通过光刺激激活这些表达ChR2的ErbB4+神经元，并在其邻近的ErbB4-神经元中记录突触后电流（PSCs）。在记录的112 个ErbB4-神经元中，当膜电位钳制在-70 mV时，其中31个神经元记录到了光刺激诱发的内向电流；当膜电位为0 mV时，所有神经元均未记录到光刺激诱发的外向电流，表明这些电流是EPSCs，而不是IPSCs。这些结果表明，表层的ErbB4+神经元通过谷氨酸传递与下游神经元进行交流。事实上，这些EPSCs能够被AMPA受体和NMDA受体抑制剂CNQX和AP-5阻断。根据这些EPSCs对TTX和4-AP的潜伏期和阻抗，可以确定，半数下游神经元接受ErbB4+神经元的单突触神经支配。用生物素标记这些记录神经元的形态特征也支持这一观点。

接下来，作者确定了ErbB4+神经元和靶细胞之间的谷氨酸传递是否受到NRG1-ErbB4信号通路的调控。在给予NRG1后的15分钟内，光刺激诱发的EPSCs的波幅显著增加，而这种作用在洗脱后减弱，表明NRG1促进谷氨酸传递。此外，给予ErbB4抑制剂阿法替尼降低了EPSC幅值，表明ErbB4激酶活性的参与谷氨酸传递。总之，这些数据证明了NRG1-ErbB4信号通路在脊髓谷氨酸传递中的作用。

8. NRG1-ErbB4信号通路参与病理性的热痛过敏

在周围神经炎症或损伤等病理条件下，机体对热刺激的反应更加敏感。在完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant, CFA）引起炎症性疼痛模型中，小鼠患肢在哈格里夫斯实验中的反应潜伏期显著降低。以下证据能够表明NRG1-ErbB4信号通路在炎症引起的热痛过敏中起作用。首先，NRG1和pErbB4在CFA注射小鼠的同侧脊髓腰膨大中的表达增加。第二，在哈格里夫斯实验中，鞘内中和NRG1能够增加小鼠撤足的潜伏期。第三，阿法替尼能够抑制野生型小鼠的热痛过敏，1NMPP1能够抑制T796G小鼠的热痛过敏。

此外，作者还研究了该通路在慢性压迫性损伤（Chronic Constriction Injury, CCI）诱导的热痛过敏反应中的潜在作用。CCI能够诱导小鼠在哈格里夫斯实验中的反应潜伏期降低，提示发生热痛过敏。与假手术小鼠相比，CCI组小鼠同侧腰膨大中NRG1和pErbB4的表达升高。野生型鞘内给予ecto-ErbB4、阿法替尼、或T796G小鼠给予1NMPP1均可降低CCI引起的热痛过敏。这些结果支持NRG1-ErbB4信号通路参与病理性的热过敏的观点。

总结

该研究通过分析热刺激感受神经元，识别出脊髓背角表层ErbB4在伤害性热刺激的感受中发挥了关键作用。这些ErbB4+神经元显示以下特性。首先，它们主要接收来自携带伤害性信息的Aδ和C纤维的单突触传入，而不是接受来自携带非伤害性信息的Aβ纤维传入。其次，ErbB4+神经元受DRG中TRPV1+伤害性传入纤维的单突触支配，对伤害性热刺激反应较好，而对机械刺激反应较差。第三，消融或抑制ErbB4+神经元减弱了动物在热板、哈格里夫斯以及辣椒素实验中的反应，表明它们的活动与伤害性热刺激的感受有关。最后，文章证明了NRG1-ErbB4信号通路在生理条件下的伤害性热刺激感受和病理条件下的热痛过敏反应中的作用。

亮点研究方法

这项工作阐述了脊髓ErbB4+神经元在伤害性热刺激感受中的作用机制。研究用到了动物手术造模、行为学评估、光遗传学、电生理记录、组织病理检测、给药以及分子检测等实验技术。瑞沃德深耕生命科学研究领域20年，一直致力于为客户提供可信赖的解决方案和服务，可提供该研究中涉及的动物手术造模、行为学评估、光遗传学、电生理记录、组织病理检测、给药以及分子检测等实验的完整解决方案。截至目前，瑞沃德产品及服务覆盖海内外 100 多个国家和地区，客户涵盖700+医院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力科研人员发表SCI文章12000+，获得行业广泛认可。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.04.021

今天要跟大家分享一篇关于M2型小胶质细胞外小泡（M2 microglial small extracellular vesicles，M2-sEVs）以及胶质瘢痕（glial scar）的研究。

先看图：

▲电镜下M2-sEVs.的形态

▲这是GFAP染色后，共聚焦显微镜下，不同处理措施（PBS、M2-sEV）下脑组织梗死区胶质瘢痕（glial scar）的形态。C：梗死中心区域；GS：胶质瘢痕区域；P：梗塞坏死灶周围区域。

再说结果：

▲ 甲苯基紫染色呈现不同处理措施下，脑组织萎缩体积的变化情况

（Sham：假手术组；PBS：脑梗死后通过尾静脉注射PBS；M2-sEV：脑梗死后通过尾静脉注射M2型小胶质细胞外小泡；miR-124-kd:通过基因敲除miR-124的脑梗死动物组）

▲ 组织梗死或存活比例情况及神经行为评分情况（mNSS）

▲ 动物转棒实验及右转实验情况

经过系列实验得出结论，也是本文的标题：《M2 microglial small extracellular vesicles reduce glial scar formation via the miR-124/STAT3 pathway after ischemic stroke in mice》即，M2小胶质细胞外小泡通过miR-124/STAT3途径减少小鼠缺血性卒中后胶质瘢痕形成。

实验研究方法，是通过阻断ICR小鼠大脑中动脉后连续7天，每天通过尾静脉注射M2小胶质细胞外小泡，来检测缺血后脑组织胶质瘢痕、梗死体积、神经功能评分情况的研究。

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值得注意的是，本篇文章是2021年1月1日发表在Theranostics，这是个对于交叉学科研究很友好的杂志，该杂志2021年影响因子高达11.556！这篇研究的成果来自于上海交通大学生物医学工程学院的科研团队。

如果你对本文的研究思路感兴趣

如果你也在研究不同类型小胶质细胞的功能

或对动物手术造模操作、miR-124/STAT3 pathway感兴趣的话

下面有个好消息告诉你

10月28日，本科研成果团队的作者之一，上海交通大学MED-X研究院科研副院长杨国源教授将做客瑞沃德大成学堂卒中基础研究系列讲座。

机会千载难逢，欢迎点击下方图片链接参与这次技术交流与经验分享的直播，通过在线提问，向杨教授面对面交流互动。

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倒置荧光显微镜MF52-N应用于细胞

几年来科学家正在开发细胞疗法，希望能治疗多种疾病和疑难杂症。这就需要质量控制和各种有关仪器设备来支持免疫疗法和再生医学的发展。近期，明美上海区域安装倒置荧光显微镜MF52-N，观察mcherry荧光，应用于细胞治疗。

倒置荧光显微镜MF52-N下，细胞均匀分布，生长状态良好。作为一种新兴的治疗方式，细胞治疗在众多疾病特别是癌症、遗传疾病、传染病的治疗中展现出良好的效果。而明美倒置荧光显微镜MF52-N为治疗提升效率与提高准确性。

倒置荧光显微镜MF52-N配备数显LED荧光模块，可实现三通道荧光激发，可选BGUYR等不同通道，激发光强直观可视并独立记忆，可用于细胞培养、生物制药、医疗检测等科研应用。

您若对倒置荧光显微镜感兴趣或存在疑问，欢迎与我们联系，我们将竭诚为您服务！

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来源：https://www.mshot.com/article/1716.html

       在非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗过程中，有可能会出现获得性耐药的问题。虽然目前已经发现了许多获得性耐药的驱动因素，但在治疗过程中导致肿瘤进化的潜在分子机制还不完全了解，治疗在多大程度上通过促进突变过程积极推动肿瘤的发展尚不明确。因此来自美国马萨诸塞州总医院的Hideko Isozaki和Ammal Abbasi等科学家发表了一篇名为《APOBEC3A drives acquired resistance to targeted therapies in non-small cell lung cancer》的文章，文中作者研究了在NSCLC靶向治疗期间，是否有特定的突变机制驱动肺癌的基因组进化。结果表明靶向治疗诱导胞苷脱氨酶APOBEC3A (A3A)突变可能促进非小细胞肺癌获得性耐药的发展。

       作者在研究中发现，临床常用的肺癌靶向治疗诱导A3A的表达，导致耐药癌细胞持续发生突变。诱导A3A可以促进了药物治疗细胞中双链DNA断裂(DSBs) 的形成，从而导致耐药细胞进化过程中的染色体不稳定性，如拷贝数改变和结构变异。通过基因缺失或RNAi介导来预治疗诱导的A3A突变可以延缓耐药的出现。因此，靶向治疗诱导A3A突变可能促进非小细胞肺癌获得性耐药的发展。A3A的表达或酶活性可能是一种潜在的治疗策略，以预防或延迟获得性耐药的肺癌靶向治疗。因此靶向治疗诱导A3A突变可能促进非小细胞肺癌获得性耐药的发展。 A3A的表达或酶活性可能是一种潜在的治疗策略，以预防或延迟获得性耐药的肺癌靶向治疗。

       在DNA双链损伤形成时,H2AX的Ser139 位点会被迅速磷酸化,从而形成γH2AX，γH2AX可以作为双链修复的标志物。文章中作者通过免疫荧光技术，利用ECHO Revolve正倒置一体荧光显微镜进行免疫荧光观察。在奥希替尼治疗2周后，我们观察到PC9细胞中组蛋白变体H2AX的Ser139磷酸化水平升高（图1），说明TKI诱导的A3A突变导致基因组不稳定，促进耐药克隆的进化。将γH2AX映射到TKI处理的PC9细胞的细胞周期分布上显示，γH2AX最显著地定位于一个恢复细胞分裂并处于G2期的细胞亚群（图2），因此，TKI治疗诱导增殖耐药细胞中A3A催化的基因组损伤。

▲图1：用1 μM奥希替尼处理PC9细胞0或14天，用γH2AX染色以量化DNA损伤。NT，没有处理；比例尺= 70μm。

▲图2：左图是用1 μM奥希替尼处理PC9细胞14天，用EdU/DAPI染色以分辨细胞周期，代表G1、S、G2细胞;比例尺= 10 μm。右图是EdU细胞周期试验的散点图，用γH2AX定量DNA损伤。NT：未处理。

       
      作者的研究结果表明，TKI治疗后APOBEC突变信号的获取可能指示了耐药克隆的进化路径，并提供了一种新的机制，通过该机制，靶向治疗可能在治疗期间无意中增加了癌细胞的适应性突变。因此，阻止A3A的表达或酶活性可能是一种潜在的治疗策略，以预防或延迟获得性耐药的肺癌靶向治疗。

参考文献：H Isozaki, Abbasi A , Nikpour N , et al. APOBEC3A drives acquired resistance to targeted therapies in non-small cell lung cancer. 2021.

DOI:10.1101/2021.01.20.426852

Revolve Gen 2正倒置一体电动荧光显微镜

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小时候在农村，看到田里灌溉使用的水泵，就会赞叹，农民终于不用再使用扁担，一桶一桶挑水来浇地了。泵，不仅节省了人力，更最主要是能将水塘里的水源源不断地供给秧苗享用。惊叹之余，也会好奇：为什么经过“它”，水就可以从低洼的水塘流向高处的庄稼地？

最近，大连理工大学宋锋玲教授课题组在《Journal of the American Chemical Society》上面发表了题为“Integration of TADF Photosensitizer as “Electron Pump” and BSA as “Electron Reservoir” for Boosting Type I Photodynamic Therapy”的文章（DOI: 10.1021/jacs.3c01042）。

该文作者思考：Type I型光敏化过程是否也可以通过一个类似的泵，来加速电子转移，从而增强光动力治 疗 效果？基于对Type I型光敏化机制中电子转移热力学问题的研究，该文作者充分利用热激活延迟荧光性质（TADF）光敏剂独有的激发态得电子能力，同时与牛血清蛋白（BSA）的富电子特性，巧妙地结合于一体，共同加速光敏剂的电子转移能力，提出了增强肿瘤光动力治 疗 效果的新策略。

Type I 型光敏剂因其对氧气比较低的依赖性，可以解决 Type II 型光敏剂因实体肿瘤乏氧带来的预后不良的问题，逐渐成为光动力治 疗领域的研究热点。Type I 型光动力治 疗机制的核心是光敏剂的电子转移能力。这个能力包括两个方面，一方面是光敏剂从底物中获得电子，另一方面是光敏剂要将捕获的电子提供给 O2 ，从而形成活性氧超氧阴离子自由基（O2•−）。然而，大多数现有的光敏剂只能单独满足其中一个方面的能力。

在本文中，作者详细探讨了一种 TADF 光敏剂PS在I型光敏化过程中的电子转移能力。由于单线激发态 S1 和三重激发态 T1 之间比较小的能极差，因此这个 TADF 光敏剂 PS 具有较大的光激发能量（ET）。在热力学上 PS 表现出类似水泵的“电子泵”的特殊电子转移能力，因为它激发态下的还原电位足够高（正），可以从底物中获得电子，并且在基态条件下还原电位也足够低（负），将电子转移到 O2 形成 O2•−。此外，我们选择了牛血清白蛋白（BSA）作为“电子储存库”，与“电子泵” PS 完 美配合。BSA不仅具有优良生物相容性和肿瘤靶向富集的优点，同时其富电子氨基酸结构组成可以作为电子的有效来源。同时 PS 和BSA 的紧密结合作用也有利于分子间的电子传递过程。实验表明，PS/BSA 复合物可显著促进I型 PDT 过程生成大量超氧阴离子（O2•−），并且，通过分子对接模拟、瞬态光谱、电化学进一步仔细地揭示了潜在的敏化机制。

随后，我们通过制备纳米光敏剂 PS@BSA ，将 BSA 和 PS 的这些电子转移增强作用整合到一个纳米粒子系统中。证实了其在体外肿瘤细胞中增强的 PDT 杀伤效果，特别是在缺氧条件下依然可以发挥很好的治 疗 效果。小鼠体内肿瘤模型同样验证了PS@BSA 在肿瘤区域的优异富集和高效的 PDT 效率。这些结果有力证实了我们提出的这种新型 Type I 型光敏剂系统对乏氧肿瘤的出色靶向能力和治 疗 效率。这项工作提出一种新的构建高效纳米光敏剂的有效策略，即采用 BSA 作为 TADF 光敏剂的功能载体来促进I型 PDT 过程。这项工作有望激发更多的 TADF 光敏剂发挥“电子泵”作用，开展的 Type I 型 PDT 研究。

图1 光敏剂PS 的电化学还原电势简易图示，描述Type I型光敏化过程中的电子转移过程。

图2 TADF光敏剂PS作为“电子泵”和BSA作为“电子水库”的简易示意图。

参考文献

Integration of TADF Photosensitizer as “Electron Pump” and BSA as “Electron Reservoir” for Boosting Type I Photodynamic Therapy，Wenlong Chen, Zehui Wang, Mingyu Tian, Gaobo Hong, Yingnan Wu, Mengzhang Sui, Miaomiao Chen, Jing An, Fengling Song, and Xiaojun Peng，Journal of the American Chemical Society. 

DOI: 10.1021/jacs.3c01042

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本文中，PS和PS@BSA的荧光寿命检测是通过HORIBA DeltaFlex全自动模块化荧光寿命光谱仪实现的。DeltaFlex全自动模块化系统能够自动识别并控制添加到仪器中的组件。在使用NanoLED短寿命光源和SpectraLED长寿命光源测试时，DeltaFlex能够快速切换光源，实现短寿命和长寿命测试。