机器人走进实验室系列（三）固相萃取篇：Extraction+互联设备实现全自动固相萃取工作流

样品制备 — 从基质中分离出目标分析物，并尽可能去除干扰，是生物分析工作流程的关键组成部分。为了获得准确、精密、可重现的实验结果，往往需要熟练且有经验的分析人员，因为任何错误或不一致都可能导致定量不准确或重做。这些错误或不一致包括在生成校准曲线和QC样品时的移液错误、遗漏或错误标记的样品、不正确的试剂添加等情况。

将自动化引入生物分析实验室不仅有助于最小化或消除这些挑战，还可以解放分析人员的双手，使其能够从事其他更高价值的工作。

下面小编就向大家介绍如何使用Andrew+移液机器人制备校准曲线，对QC样品（血浆中的多种小分子药物）进行稀释。目标分析物包括乙酰唑胺、扑热息痛、泼尼松、2-甲基苯甲酰胺、可的松、美托洛尔和阿米替林。然后，使用Andrew+搭配Extraction+模块，对样品进行全自动SPE。制备好的样品使用LC-MS进行定量分析，获得校准曲线结果以及重现性和回收率指标。

图1. Andrew+搭配Extraction+ SPE新模块，执行自动化SPE样品制备和LC-MS分析工作流，分别使用Oasis HLB SPE小柱和SPE萃取板。

 优势

使用Andrew+ Robot搭配Extraction+固相萃取新模块，可实现标准曲线制备、QC样品稀释和无人值守的全自动SPE工作流；

OneLab软件拥有简洁直观的用户界面，便于用户轻松设计和执行各种自动化样品制备方案，轻松实现方法创建和方法转移；

1cc、3cc和6cc固相萃取小柱或96孔萃取板均可在Extraction+互联设备上实现固相萃取；

受OneLab软件控制的可编程的真空泵压力曲线可提高SPE方法的重现性。

实验方案一

制备校准曲线，样品稀释，使用Oasis HLB 1cc SPE小柱执行固相萃取 

样品进行反相固相萃取工作流：

*注意：沃特世于1996年推出Oasis HLB, 是所有Oasis吸附剂的主要成分。可耐受pH 0-14，采用独特的水可浸润性聚合物吸附剂，省去了活化和平衡步骤，是SPE的新标杆。

以Andrew+移液机器人进行全自动SPE为例，介绍OneLab软件中的自动化方法，Andrew+将上图所示的SPE步骤自动化。

图2. 左侧为OneLab的方法创建界面，右侧为SPE工作流使用的移液枪、枪头、Dominos和Device物料清单。

Andrew+移液机器人搭载Extraction+ SPE新模块的仪器配置如下图，包括：

Andrew+ Robot主机；

微孔板抓手（自动移动96孔板）；

Extraction+配套的真空泵（压力曲线受软件控制）；

废液瓶（上样和清洗产生的废液，经真空泵抽取，进入废液瓶）；

Extraction+配套的萃取套件（上部放置SPE小柱或萃取板，下部放置收集容器）；

放置SPE小柱或萃取板的位置（左侧升降Lifter可将承载SPE小柱的架子移到左侧，以便用微孔板抓手将收集容器放入下部）。

实验结果

使用 沃特世ACQUITY UPLC I-Class液相系统搭载快速柱进行色谱分离，再用 Xevo TQ-XS串联四极杆质谱仪对从血浆中萃取出的小分子药物进行检测。分析3个浓度的血浆样品(Low QC-10 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-150 ng/mL)，回收率范围是95.8% - 108.4%，精密度结果是几乎所有RSD%值≤5%。这些结果满足FDA对小分子生物分析方法验证的推荐限值。

表1. 回收率和重现性结果 — Andrew+执行血浆样品制备，Extraction+搭载Oasis HLB 1cc SPE小柱执行全自动SPE。

实验方案二

制备校准曲线，样品稀释，使用Oasis HLB 30mg 萃取板执行固相萃取 

与实验方案一执行同样的反相固相萃取工作流，萃取耗材是Oasis HLB 30 mg plates。

 实验结果

使用沃特世ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱系统搭载快速柱进行色谱分离，再用Xevo TQ-XS串联四极杆质谱仪对从血浆中萃取出的小分子药物进行检测。分析3个浓度的血浆样品(Low QC-20 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-400 ng/mL)，回收率范围是88.6% - 110.8%，精密度结果是大多数RSD%值≤5%。这些结果满足FDA对小分子生物分析方法验证的推荐限值。

表2. 准确度和精密度结果 — Andrew+执行血浆样品制备，Extraction+搭载Oasis HLB 30 mg plates执行全自动SPE。

毒品吸食后经人体代谢会被排入生活污水中，依据“污水流行病学”对特定区域生活污水中的毒品原药或其代谢物含量进行检测，再结合污水流量和污水处理厂服务区域的人口数量，就可以评估和判断污水厂服务区内毒品滥用情况并进行层层溯源。

“污水验毒”不仅可用于监测城市或地区的毒品滥用情况，还可以通过监测污水中毒品的异常情况为追查制毒窝点、打击毒品犯罪和预警新精神活性物质等提供线索。但由于该方法属于纳克级检测，且污水量大、基质复杂，对前处理仪器提出了很高的要求。

屹尧科技的“全自动固相萃取-液相色谱-串联质谱同时测定污水样品中10种常见毒品毒物的分析方法”，采用EXTRA全自动固相萃取仪进行污水样品前处理，既可快速、GX自动连续处理大批量污水样品，又可确保样品分析的稳定性和平行性。EXTRA采用高精度工业级丝杆机械臂搭载定量环进样方式，确保样品不进入泵阀，配合液位追踪和流动式清洗功能，避免仪器本身带来的交叉污染风险，对真实数据做出更精确的解读。

全自动固相萃取-液相色谱-串联质谱同时测定污水样品中10种常见的毒品毒物

仪器和材料

EXTRA全自动固相萃取仪；N1全自动氮吹浓缩仪；液相色谱-串联质谱仪（AB SCIEX Exion LC-Triple Quad 5500）；MCX阳离子交换柱（WondaSep MCX 60mg/3mL）

污水样品前处理方法

污水样品充分摇匀后，加入盐酸调节pH值小于2，使用溶剂过滤器和玻璃纤维滤膜过滤，取滤液50mL于50mL 离心管中，进行固相萃取净化。

固相萃取净化步骤

洗脱液采用N1全自动氮吹浓缩仪在40℃条件下氮吹浓缩至近干，用250 uL 0.1%甲酸水复溶后，过滤膜上LC-MS/MS进行分析。

液质联用条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 (100mm ×2.1 mm×1.7 μm )

流速：0.40 mL/min

柱温：40°C

进样量：5 μL

检测器：AB 5500

离子模式：ESI+

流动相：A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸乙腈

洗脱梯度：

方法学验证：

空白样品中添加浓度为0.05 μg/L的10种毒品标准品，按照上述步骤进行操作，结果表明：10种化合物的平均回收率在88.9%~106.3%之间，RSD小于5.0%。

总结：

采用EXTRA全自动固相萃取仪配套N1全自动氮吹浓缩仪进行污水样品前处理，可连续自动处理40个污水样品。SPE步骤完成后无需更换试管，即可自动完成固相萃取和氮吹浓缩全过程，减少工作人员长时间接触有毒有害溶剂，确保方法的稳定性和平行性，避免交叉污染的同时，有效提高工作效。

固相萃取是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更***将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力。***的应用在医药、食品、环境、商检、化工等领域。 萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作，萃取有两种方式： 液液萃取，用选定的溶剂分离液体混合物中某种成分，溶剂与被萃取的混合物液体不相溶，具有选择性的溶解能力，而且有好的热稳定性和化学稳定性，并有小的毒性和腐蚀性。如用苯分离煤焦油中的酚；用有机溶剂分离石油馏分中的烯烃等。 固相萃取，也叫浸取，用溶剂分离固体混合物中的成分，如用水浸取甜菜中的糖类；用酒精浸取黄豆中的豆油以提高油产量；用水从中药中浸取有效成分以制取流浸膏叫“渗沥”或“浸沥”。 虽然萃取经常被用在化学实验中，但它的操作过程并不造成被萃取物质化学成分的改变（或说化学反应），所以萃取操作是一个物理过程。 萃取蒸馏是在有一种易溶、高沸点，并且不挥发的组分存在下的蒸馏，而这种溶剂本身并不与混合物中的其他组分形成恒沸物。萃取蒸馏通常用来分离一些具有很低的甚至相等的相对挥发度的物系。由于混合物中两组分的挥发度接近相等，使到他们在接近相同的温度下蒸发，而且蒸发的程度也相近，从而使分离变得困难。因此，相对挥发度很低的物系通常很难被简单的蒸馏过程所分离。 萃取蒸馏使用一种一般不挥发、具有高沸点，并且易溶的溶剂与混合物混合，但却并不与混合物中的组分形成恒沸物。这种溶剂与混合物中的各个组分发生不同的作用，令到他们的相对挥发度发生变化。从而使到他们可以在蒸馏过程中分离开来。挥发度高的组分被分离开并形成塔顶产品。塔釜产品则由溶剂和另一组分混合而成。由于溶剂并不与另一组分形成恒沸物，因此他们可以再用适合的方法分离开。 这种蒸馏方法的一个重要部分就是溶剂的选择。溶剂在把两组分分离开的过程中扮演着重要的角色。值得注意的是，在选择溶剂时，溶剂需要能***改变相对挥发度，否则便会是徒劳的尝试。同时还要注意溶剂的经济性（需要使用的量、其本身的价格和其可用性）。还要容易在塔釜中分离开来。并且不能与各组分或混合物发生化学反应；也不能在设备中引起腐蚀。一个典型的例子 就是用苯胺或其他合适的替代品作为溶剂，萃取蒸馏苯和环己烷形成的恒沸物。 固相萃取是一种用途***而且越来越受欢迎的样品前处理技术，它建立在传统的液-液萃取基础之上，结合物质相互作用的相似相溶机理和目前***应用的HPLC、 GC中的固定相基本知识逐渐发展起来的。SPE具有有机溶剂用量少、便捷、安全、高效等特点。 SPE根据其相似相溶机理可分为四种：反相SPE、正相SPE、离子交换SPE、吸附SPE。 SPE大多数用来处理液体样品，萃取、浓缩和净化其中的半挥发性和不挥发性化合物，也可用于固体样品，但先处理成液体。目前国内主要应用在水中多环芳烃和多氯联苯等有机物质分析，水果、蔬菜及食品中农药和除草剂残留分析，***分析，临床***分析等方面。 SPE装置由SPE小柱和辅件构成。SPE小柱由三部分组成，柱管、烧结垫和填料。SPE辅件一般有真空系统、真空泵、吹干装置、惰性气源、大容量采样器和缓冲瓶。 一个样品包括分离物和干扰物通过吸附剂；吸附剂选择性的保留分离物和一些干扰物，其他干扰物通过吸附剂；用适当的溶剂淋洗吸附剂，使先前保留的干扰物选择性的淋洗掉，分离物保留在吸附剂床上；纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。

1、流动相

A、流动相纯度：

建议使用色谱纯及以上的级别的流动相（乙酸乙酯：环己烷=1:1或二氯甲烷）。

B、流动相应满足实验过程需求

使用前，请务必要按照凝胶净化色谱柱上的标签规格（乙酸乙酯：环己烷=1:1或二氯甲烷）要求配置相应的的流动相，流动相应满足实验过程需求，对于柱体上标有流动相为乙酸乙酯：环己烷=1:1的凝胶色谱柱,流动相只能使用（乙酸乙酯：环己烷=1:1）,尤其是不能使用二氯甲烷作为它的流动相,否则将会对凝胶色谱柱的填料的膨胀系数造成影响,从而使得柱子不能够有效的使用。需要使用0.45微米的滤膜过滤并超声脱气混合均匀。

C、流动相的用量:

由于方法中的流速为5mL/min，如果实验样品的数量很多，应该一次性配好流动相充足的量，避免中途在往试剂瓶里添加。否则易产生气泡，导致基线不稳。

2、样品溶剂的选择

在使用GPC时,请注意样品溶剂对凝胶色谱柱的影响, 即，在选择样品溶剂时，应该选择与流动相极性相符的溶剂，尽量使用流动相作为样品溶剂。

3、对样品溶液的要求

所有的样品溶液均需过0.45微米（0.22微米）的滤膜处理，否则可能会将样品中的固体颗粒引入电磁阀，造成电磁阀因堵塞而损坏。

4、输液泵压力偏高

如发现控制面板上的输液泵压力变大或报警停泵时，请将仪器的放空滤片座卸下来用流动相超声清洗10~20min后，再安装上使用。

5、在较长时间内不使用GPC凝胶系统时

请您先用对应的流动相将凝胶色谱柱冲洗10～20min，然后取下，用特有的聚四氟堵头将其两端封好，在下次使用时再重新安装上，然后以其所使用的流动相冲洗十分钟以上（使其基线达到平稳）后，在进行使用。

6、GPC管路的清洗

若使用GPC与浓缩仪器做茶叶等颜色较深的样品时（当回收率降低时），请每隔半个月将凝胶净化色谱柱拆下来，用一个不锈钢两通替代柱子连接管路，然后把流动相换成甲醇：丙酮（1:1），冲洗管路一个小时，然后换回流动相冲洗二十分钟，再把凝胶柱安装上，再做实验。

7、保护柱（预柱）的清洗

当回收率降低时，如有保护柱（预柱）的话，用甲醇：丙酮（1:1），低流速反向冲洗二十分钟。

8、浓缩杯的清洗

当回收率降低时，查看浓缩杯是否脏污，如脏污，建议将浓缩杯取下，用浓硫酸或10%的稀硝酸清洗，再用纯水洗净吹干，再使用。

9、浓缩仪氮气与真空压力的调节

在使用Liqvap浓缩仪时,请将真空泵的负压表部分的量程调到-40kpa左右,氮气压力表的出口量程调到0.05Mpa左右（仪器的后面也有一个小的分压表也调到0.05Mpa左右，SPE 与之相同，小的分压表也调到0.05Mpa左右）.(一般在工程师安装调试完成后,则不需要客户再做其他的操作)。

10、及时关闭输液泵

实验结束后，请点击工作站左侧下方的【手动操作】按钮，选择【GPC信息】项，点击【输液泵】中的【停止】按钮，将输液泵关闭后，再关闭工作站，然后分别将仪器及电脑的电源关闭。

11、避免烫伤

在使用过程中，请勿用手触碰浓缩仪的加热外壁，以免将手烫伤。

12、及时倾倒废液

请注意及时处理废液瓶，以避免废液过满而流出所造成的污染。

13、SPE管路的填充

请在仪器运行之前，对相应的管路进行填充排气操作；方法为：手动控制中，选中“注射器”下方的“溶剂类型”中的“Solvent-1”等，然后点击【所有通道】各两次，再点击“清洗”栏下的【进样针】二次【注意！不能连续点击，只能是一次一次的操作】。（更换溶剂或方法、长时间不用仪器时操作此步）【注：具体情况根据方法中使用几种溶剂，比如方法中只含有两种溶剂，只填充对应通道即可。】

14、固相萃取小柱的选择与摆放

在使用过程中，请在运行前选择相应类型（1mL、3mL和6mL）。切记不可在同一批表下运行不同类型的固相萃取小柱。并按批表的设置，摆放好对应的固相萃取小柱。

15、自动液体处理器的维护

请您在使用过程中不要随便移动、变更样品盘上的样品架，因为该位置在安装时已经调整好，移动、变更样品盘上的样品架，将可能会发生进样针折断等事故。在实验结束以后，请尽可能的对其做一些防尘措施，以便延长其使用的寿命。

1 压力确认

每次运行方法前，请做好准备工作，检查氮气瓶总压力0.5Mpa，溶剂表的压力设置为0.1 Mpa，样品的压力设置为0.05 Mpa左右；压力调节时若要调低压力请降低后再增大到你要降低的那个压力，保证是朝同一个方向调，因为压力表在泄压时有个过程看着压力降到了，但一段时间后压力会更低，所以降低后再反转，大体积时根据脏污程度和流速在0.03-0.1之间调节，说明书后面附录有不同压力下对应的大致流速，客户可参考。

2 溶剂确认与设值

实验前，要先检查溶剂是否充足，因为仪器是正压上样，所以溶剂要准备的充足。同时，在使用前，请注意设置PC通讯和溶剂设置两项。一定要在方法设置之前，先设置好溶剂名称，否则将不能正常编辑方法。

3 收集架的设置

Sepaths的收集架是两排，可实现分布收集，在摆放收集管时需注意，里面是1号位，也是默认位置，外面是2号位。

4 大小体积的切换

实验过程中，需注意在编辑方法时，注意上扬的体积，体积小于25ml时，使用小体积适配时，在编辑方法时要注意将淋洗、洗脱的体积类型设置。

5 柱塞清洗

柱塞在使用前和使用后必须马上用乙醇进行清洗。

6 其他

样品瓶管口应转向低的一侧，同时确认萃取柱接头有没有安装好，收集架装好没有，废液管准备好没有。

以上为本机操作和简明维护说明，更详细的说明请参阅本机使用说明书或致电本公司客户服务ZX。

客服电话：400-838-7877