直播精彩回顾：LS18平铺光片显微镜及组织透明化技术应用

2022年7月8日, 锘海线上直播围绕LS18平铺光片显微镜技术、生物组织透明化技术、测样服务平台以及LS18平铺光片显微镜应用案例等主题进行报告和展示。在报告互动环节中，各位老师就目前课题方向提出诸多代表性疑问，让我们一起回顾下精彩问答。

Q: 什么是平铺光片技术？以及该技术的控制的原理是怎样的？

A：平铺光片技术是一种新型的选择性平面照明显微镜（SPIM）三维成像技术，在不增加光片厚度、不降低激发光片约束能力的情况下，增加SPIM的FOV。如图1所示，在探测焦平面内沿光片长轴方向(y方向)平铺小而薄的光片，在每个位置拍摄一幅图像，将所有图像组合并重建整个FOV的图像。 

平铺光片技术的控制原理：

在成像时，无论是通过移动物镜或是移动样本等物理方式，都会影响成像质量，造成artifacts。LS18光片显微镜创新地采用平铺光片模式，通过对空间光调制器加载不同的相位图以对激发光束进行调制，实现快速平铺短而薄的光片，扩大了FOV且不影响空间分辨率和光学层析能力，从而获得均一的高分辨率3D图像。空间光调制器对激发光相位进行调制几乎可以解决所有的光片校准问题，真正地实现显微镜仪器的自动校准，并且性能非常稳定，易于操作和维护。另外，根据不同样品的研究需求，LS18光片显微镜能够灵活地调整光片平铺次数以及成像速度，实现不同类型的完整组织器官的3D结构与功能测量。

图1. TLS-SPIM的工作原理，（左）通过快速平铺小而薄的光片，（右）在每个位置拍摄一幅图像，将所有图像组合重建整个FOV的图像，使得视野范围内各处成像分辨率均一。

关于平铺光片技术的详细原理可参考以下文献：

1. Gao, Liang. Extend the field of view of selective plan illumination microscopy by tiling the excitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2. Fu Q , Martin B L , Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications, 2016, 7:11088.
 

Q: 用lectin标记血管时，是尾静脉注射后再取器官然后透明化，还是先透明化再用染色仪器将lectin标记上?
A: 血管标记透明化和染色顺序问题，在实验案例当中，两种方式我们都有尝试过，实际上它都是可行的。首先，lectin的尾静脉注射方式对整个灌注流程来说，需要非常大的技术把控性。如何做到良好的静脉内注射并维持小鼠一定时间的存活率，对于实验室新手可能需要多加练习。由于lectin具有半衰期，可参考发表文献中的操作步骤，根据代谢动力学来选择一个合适的时间，需要注意的是在灌注流程过程当中剥离取材时间或者说lectin的孵育时间。同时，有些客户送到我们这边的样本可能在前期经过灌注后会产生荧光淬灭的问题，我们可以选择性帮老师做巩固结构及加强染色步骤。对于加强染色这部分，可用lifecanvas 的SmartBatch+主动式透明化/染色一体电泳仪，亦可采用传统的被动渗透式方法来实现。

Q: 请问哪种透明方法和免疫染色结合的比较好?
A: 透明化方法和免疫染色的结合目前为止没有好坏之分，大组织样品免疫染色目前是世界性的难题，从目前众多老师和我们测样的经验来看，油性染色方法中idisico和Pegasos的方法都比较可行，但是idisco涉及甲醇的脱水步骤，所以对抗体和甲醇的兼容性要求比较高，有条件的用户我们建议可以先做个兼容性测试，这样有助于提升后期染色的效率。

通常来说，荧光基团在水性的环境当中保存性更好。所以，如果样品可以满足水性透明化方法的前提下，可以尽量尝试采用水性透明化方法，同时关注指标染色特异性及有效性。

此外，大组织免疫染色还与样品大小有关。在不同组织中，如：对于肠道、肺、整脑、整个脑连脊髓、心脏等各类样品，方法和步骤都有区别。所以透明化方法一定要和免疫染色指标综合考虑，才能寻找”更优解“，跟我们目前有限的经验，需要根据样品和染色指标来进行综合筛选，寻找合适的组合。

Q: matrigel细胞外基质胶可以通过哪几种透明化方法处理？
A：涉及matrigel细胞外基质的样品一般多是类器官样品，此类样品可以通过多种方法透明进行透明化和染色。因为这类样品相对whole tissue来说一般体积较小，所以这个情况下，实际上有多种透明化方法可尝试，甚至可以结合我们更新的膨胀技术达到纳米级别的分辨，在3D纳米级水平完整展示整个类器官样品形貌。为方便广大科研老师，我们锘海依托大量实验案例开发出的组织透明化试剂盒（#NH-210701）就可以应用于类器官的透明化，试剂盒附有详细实验步骤可供老师选择。

Q: 采集的图像信息量很大，如何进行数据处理？大量的光学切片需要拼接，软件怎么选择？另外，用什么软件实现细胞分割和单细胞追踪？定量分析可以采用第三方软件吗？图像输出是什么格式？

A：平铺光片显微镜采集的大样本成像数据量能达到几百GB或TB级别，可通过锘海自主研发的数据预处理软件对采集图像预处理，输出.3dtiff格式的原始数据供第三方数据分析软件调用（如图2所示）。通过第三方软件或自主拼接软件即可实现将所有ROI数据都拼接在一起，得到一个完整样品的3D数据（如下图所示）。

图2. 平铺光片经数据提取后得到全视野高分辨率的图像

目前能实现3D大图拼接的第三方软件有很多，如Amira、Imaris，均可以对.3dtiff格式原始数据进行处理，可实现常规的单个区域数据结果快速查看、单个区域数据动态展示、大样本数据整体拼接、大样本组织整体图像处理及展示等操作。另外，3D成像的数据处理对电脑性能配置也有一定的需求，一般推荐128GB以上内存，4T以上的SSD，并需配备较高性能独立显卡。

上述这些第三方的专业图像处理软件均有相应的图像分析模块，可实现分割、单细胞追踪及定量分析等功能。

Q: 组织透明化对组织本身有化学损伤吗？会破坏组织内荧光物质（如GFP）吗？

A: 组织透明化方法分为主动式透明化方法和被动式透明化方法两个大类，以引入外力或生化试剂的被动扩散来完成对组织的透明化，组织透明化技术保留了组织的细胞间连接和细微特征。不同的组织透明化方法因其机理不同，对组织的形态、透明程度、透明效率、脂质留存、内源性荧光信号、核酸物质、免疫染色等的影响不尽相同。例如被动式透明化方法中的有机溶剂透明化方法，通过先脱去组织的水分，再利用高折射率的有机溶液进行折射率匹配，虽然达到很好的透明效果，但是对于荧光蛋白的信号产生淬灭作用。荧光蛋白中的亲水基团使得亲水溶剂透明化方法更有利于荧光的保存。被动式的亲水溶剂透明化方法通过浸泡将低折射率的组织液、细胞液或是高折射率的脂质逐渐替换，实现折射率一致，这类方法虽然更利于荧光保存，但耗时较长。基于CLARITY/SHIELD技术的主动式透明化方法从保护荧光蛋白构象出发，不仅能留存内源性蛋白、核酸，还通过电泳加速移除脂质，使透明化的效率提高。

参考文献：

冯异. 医学组织透明化三维成像 [M]. 复旦大学出版社，2020：3-21.

Chung et al., Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 2013.

Park et al., Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology, 2019. 

     直播视频回放：

https://v.qq.com/x/page/g3347h98jn8.html?sf=uri

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