qPCR实验——核酸提取那些事

前言

MIQE是描述评估qPCR实验所需的最小信息，该指南是稿件投稿时需要同时提交的一个清单。通过作者提供相关的实验条件和实验特点，审稿人可以评价实验所用方法的可靠性。另外提供详细的实验所用试剂、序列和分析方法，其他研究人员可以利用这些信息进行重复实验。

对于核酸提取MIQE有明确要求两点——实验组与对照组的定义及每一组的样本数量。

无论采用手工法还是试剂盒，只要符合MIQE的要求并实现良好的可操作性和重现性，就是合理客观的技术方法。MIQE在该部分操作中的要求又分为两大块——样本描述和核酸提取方法。

样本描述

▶  样本采集和处理的方法描述

▶ 样本的来源描述（宏观解剖还是激光显微切割）

▶  样本是如何即时处理（保存条件及时间）

▶  冷冻样本的冷冻方法和时间

核酸提取

采取的提取方法：

1）手工法：小批量经济型

2）自动化仪器：大批量高效型

按获取的物质可分为DNA和RNA：

◆ DNA：适合拷贝数变异、SNP分析等实验

◆ RNA：适合基因表达、长非编码RNA等实验

图源：网络，侵删

按提取方法分为化学法和机械破碎法：

◆ 化学法：适合采用碱裂解法的样本，质粒提取、菌类的提取

◆ 机械破碎法：比较坚硬有一定韧性的物质，动植物组织

更推荐使用合适的商品化的核酸提取试剂盒，流程标准化程度更高，质量更容易得到保证，这样在方法描述时可以更简单一些，直接引用试剂盒的生产厂家、货号和名称即可。

DNA酶或RNA酶的处理细节：

基因表达实验中，RNA模板如果存在DNA污染，会严重干扰最后的结果。因此提取RNA时要加入DNA酶将DNA消化掉，工作浓度、处理温度和时间要加以说明，同时也要加入RNase抑制剂提供保护。使用柱纯化试剂盒提取RNA时也可以在柱上进行DNA消化。同样的，提取DNA时也要将RNA消化掉，尽管残留RNA对DNA为模板的qPCR实验影响小得多。

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☑  数据可靠性：连续1000次实验后，结果高度一致。

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☑  在线便捷性：主机可独立运行qPCR程序，数据可USB、Wi-Fi等网络传输。