收藏 | 病毒采样管灭活效果测试

根据《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》通知，“人群筛查应选择具有病毒灭活功能，如含胍盐（异硫氰酸胍或盐酸胍等）或表面活性剂的采样管。”

灭活型病毒采样管可高效灭活病毒，保护病毒核酸不被降解，且能在常温下保存较长时间，为样品保存及运输节省成本。选择灭活效果好的病毒采样管，有助于确保后续核酸检测质量。

本期实验，我们选取逗邦®一次性使用病毒采样管进行灭活效果测试，过程如下：

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实验材料

病毒采样管：

逗邦®一次性使用病毒采样管（灭活型）

实验材料：

慢病毒（吉凯基因，GCNL0319432），HEK293T细胞

核酸提取试剂盒和提取仪：

逗邦®（BNP027-2B, M32)

新冠荧光PCR试剂盒：

圣湘（N083-5X0001）

逗邦®一次性使用病毒采样管（灭活型）

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实验方法

参考《消毒技术规范》（2002版）病毒灭活试验中描述的检测方法，确定病毒保存管灭活能力。

步骤一：细胞培养

将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1×104/mL，按照100μL/孔的体积，每个梯度的病毒做三个复孔，计算所需接种孔数，将细胞缓慢均匀接种至96孔板中。放入37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。

步骤二：慢病毒稀释

将病毒滴度为107-108TU/mL的慢病毒按10倍梯度进行稀释，连续稀释3个梯度。

步骤三：病毒灭活

把稀释好的病毒置于室温条件下，与灭活款病毒保存液（批号：220201/220207/220211）按1:1体积比进行混合，置于室温下分别放置1min、5min和10 min进行灭活。

步骤四：终止灭活

采用病毒分离培养基（可用DMEM完全培养基替代）进行1000倍稀释以中和灭活保存液，终止灭活。

阴性对照：为病毒分离培养基对灭活款病毒保存液稀释1000倍的混合液；

阳性对照：为病毒分离培养基对病毒原液稀释1000倍的混合液。

步骤五：病毒孵育

将事先培养的HEK293T细胞中吸弃细胞培养基，每孔加入100μL准备好的病毒混合液，和对应的阳性对照、阴性对照。病毒孵育3小时，每隔30分钟从培养箱中取出晃动一次。

步骤六：细胞培养

孵育结束后，将病毒液吸去，每孔中加入100μL DMEM完全培养基，将96孔板置于37℃，5% CO2培养箱中培养，并观察细胞状态。

步骤七：荧光细胞观察与计数

继续培养48-72h，期间观察细胞状态，若细胞培养液变黄，应换液，对荧光细胞个数适量的孔进行计数，计算病毒滴度。

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实验结果

图1：三批次灭活款病毒保存管在病毒灭活

不同时间后细胞生长情况

表1：三批次灭活款病毒保存管在病毒灭活

不同时间后病毒滴度情况

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实验结论

由图1和表1数据可以看出，慢病毒经灭活1min、5min和10min后感染HEK293T细胞后，在显微镜明场下细胞生长正常；三批次的灭活款病毒保存管与病毒作用5min后，可以有效灭活病毒。