Neuron：北大李毓龙课题组构建一种全新的ATP荧光探针

文章概述

三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一种广泛存在于体内的能量存储分子。除了参与细胞内的能量代谢功能外，越来越多的证据表明，释放到细胞外空间的ATP可以作为一种分子信号（嘌呤能递质），能够结合并激活离子型P2X受体以及代谢型P2Y受体。在神经系统中，释放的ATP参与了多中生理病理过程，包括痛觉感受、机械/化学感知信号转导、突触传递、损伤、炎症等。对于ATP在这些生理过程中的作用，目前的研究并未完全阐明。为了进一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大学生命科学学院李毓龙教授团队发表在《Neuron》期刊上发表题为“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究论文，该项工作展示了团队最新开发的一种可遗传编码的荧光分子探针——GRABATP1.0（简称ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），该探针以P2Y受体作为ATP的结合支架，能够对细胞外的ATP进行高灵敏度、高选择性以及高时空分辨率的实时测量。该项工作是李毓龙教授团队在相继开发了乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探针之后的后又一重要成果，对于我们深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意义。

核心观点

1、ATP1.0是一个可遗传编码的细胞外ATP感受器；

2、ATP1.0对于细胞外ATP具有高敏感性和高时空分辨率；

3、ATP1.0可用于离体以及在体ATP释放的实时监测。

研究结果分析

1. ATP1.0表现出卓越的细胞外ATP检测性能

为了开发一个遗传编码的ATP荧光探针，研究者首先系统地筛选了能够被ATP激活的G蛋白耦合受体（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以这些GPCRs作为支架，研究者将结构敏感的绿色荧光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到这些受体结构中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表现出最佳的膜转运和对ATP的响应性，因此随后研究者选择了基于hP2Y1的嵌合体ATP0.1进行进一步优化，并且最终得到了对ATP荧光响应性最 好的ATP1.0。当ATP1.0在HEK293T细胞中表达时，它能够很好的被运输到细胞膜上表达，并对细胞外100mM的ATP产生一个~500%的dF/F0峰值。在特异性方面，ATP1.0对细胞外ATP的反应能够被P2Y1的拮抗剂MRS-2500阻断。ATP1.0对其它递质不会产生反应，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、血清素、组胺和乙酰胆碱等，对二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反应与ATP类似，但是对于其它结构类似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等几乎不产生反应。ATP1.0的反应具有快速动力学的特征，其反应平均上升时间常数约为28 ms，平均衰减时间常数约为283 ms。在荧光强度上，ATP1.0被ATP激活时的亮度达到了直接表达hP2Y1-EGFP融合蛋白荧光强度的64%，并且ATP1.0在单光子激发下的光谱与EGFP相似，激发峰在500 nm，发射峰在520 nm。在与其它细胞外ATP分子探针的比较中，ATP1.0表现出更大的动态检测范围、更强的荧光反应、以及更低的信噪比。

接下来，研究者探讨了ATP1.0在原代培养的星形胶质细胞和神经元中的表达能力以及反应性。ATP1.0能够广泛的表达到星形胶质细胞和神经元的细胞上，包括胞体、突起等部位。表达到星形胶质细胞和神经元上的ATP1.0对细胞外ATP均有较好的反应，其平均dF/F0峰值分别约为1000%和780%。此外，ATP诱导的荧光反应也能够被P2Y1、受体拮抗剂MRS-2500阻断。此外，与HEK293T中结果相似，神经元中表达的ATP1.0对ATP和ADP均有反应，但对一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均无反应。更重要的是，ATP1.0在细胞表面非常稳定，在给予10mM 的ATP 两小时后，表达ATP1.0的神经元的荧光没有出现明显下降。综上所述，ATP1.0能够适用于多种类型的细胞，对细胞外的ATP产生高灵敏度、高选择性和高稳定性的荧光增强反应。

2. ATP1.0可用于监测体外培养细胞外的ATP水平

接下来，研究者测试了ATP1.0是否能够用于检测神经-胶质共培养细胞中内源性ATP的释放。在大脑中，机械刺激和细胞肿胀均能诱发胞内ATP被释放。在表达ATP1.0的细胞中，给予细胞机械刺激（利用玻璃微电极按压某个细胞），能够引起一个快速、局部增强的dF/F0信号，反映了ATP的释放。为了诱导细胞肿胀，研究者将细胞浸泡在低渗溶液（130 mOsm/kg）中;在1min内，dF/F0信号显著增加。并且在应用MRS-2500后，这两种刺激引起的反应都被完全抑制。研究者还发现，低渗刺激诱导的ATP释放可能不需要依赖经典的SNARE囊泡释放机制，因为细胞表达了破伤风毒素轻链（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突触短肽并阻止胞外分泌过程），但是对低渗刺激诱导的反应没有影响；而作为对照，表达TeNT阻断了低渗刺激诱发的谷氨酸释放。除了刺激诱发的ATP释放外，研究者还观察到，即使在没有外部刺激的情况下，神经-胶质共培养细胞中也存在自发、局部、以及短暂的ATP1.0信号。在1.6mm2成像视野中，这些自发事件以1.2次/min的速率出现，其dF/F0的平均峰值约为210%。ATP自发释放的平均上升时间约为11s，衰减时间约为43s，其释放范围的平均直径约为32mm。为了确保ATP1.0信号反映了细胞外的ATP动态变化，研究者利用三磷酸腺苷双磷酸酶（ATP的水解酶）对细胞进行处理并成像，观察到三磷酸腺苷双磷酸酶能够显著阻断自发事件的发生。与以前的检测手段相比，ATP1.0具备更高的灵敏度，能够在普通条件下特异性的检测ATP的释放。

3. ATP1.0可用于监测斑马鱼幼体中ATP的动态变化

在证明了ATP1.0可用于体外ATP的检测后，研究者接着探讨了它是否可以用于监测体内（如斑马鱼中）ATP的动态变化。在斑马鱼幼体神经元中特异性地表达ATP1.0后，利用ATP局部处理会引起视顶盖中dF/ F0信号出现强烈的瞬时增加，这些信号能够被MRS-2500阻断。在验证了ATP1.0能够对外源ATP做出反应后，研究者进一步探讨了ATP1.0是否能够用于检测活斑马鱼内源性ATP的释放。ATP信号在促进小胶质细胞向损伤部位迁移中发挥关键作用。在表达ATP1.0的斑马鱼中，研究者发现激光消融诱导视顶盖损伤后会导致荧光增强，其反应从损伤部位向外呈放射状传播。损伤后11s和64s释放ATP的范围，其平均直径分别为~23mm和~34mm。接下来，研究者通过在斑马鱼的视顶叶中表达ATP1.0，同时监测ATP的释放和小胶质细胞的迁移，斑马鱼的小胶质细胞用红色荧光蛋白DsRed标记。研究者们发现，在激光消融后，小胶质细胞沿着ATP传播路径逐渐迁移到损伤部位。因此，ATP1.0非常适用于活体斑马鱼幼虫ATP监测，并且具有较高的时空分辨率。

4. ATP1.0可用于监测小鼠全身炎症引起的ATP局部释放

ATP是应对机体急慢性炎症反应的关键细胞外信使，但是在全身炎症期间ATP释放的模式还不清楚。研究者在小鼠腹腔注射细菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导全身炎症，并通过双光子显微镜来观察直接观察视觉皮层ATP1.0的荧光反应。注射LPS 24小时后，研究者观察到皮质内多次ATP局部释放事件，在记录的20min内，其发生频率约为5 – 10次/min。在星形胶质细胞中，ATP释放的上升时间相对较快（<5s），衰减时间较慢（10-20s）。此外，ATP的释放具有空间选择性性，信号的平均直径（根据每个事件的最大直径确定）约为9.9mm，小于典型星形胶质细胞的平均直径（10-20mm）。为了研究ATP释放与炎症进展之间的相关性，研究者记录了注射不同剂量LPS（分别为0.5和10 mg/kg）后不同时间点的皮质ATP释放情况。研究者发现，在注射LPS后30 min内，ATP释放均有所增加，且释放次数随时间逐渐增加，并分别2h和6h时达到顶峰。对ATP释放的位置分析显示，早期ATP释放发生在相对靠近血管的地方，随后释放距离逐渐增加。这些数据表明，大脑可以感知炎症，并以具有空间选择性的ATP释放的形式做出反应，这些结果表明ATP1.0适用于小鼠在体成像，同时兼备高灵敏度和高时空分辨率。

总结

该研究报道了一种全新的基因编码的ATP荧光探针——ATP1.0，该探针能够高灵敏度地检测脑组织中ATP的动态变化。ATP1.0可以在多种类型细胞中稳定表达，包括细胞系、星形胶质细胞和神经元，为测量细胞外ATP提供了可靠的工具。此外，利用ATP1.0可以实现体外及在体ATP释放的可视化实时监测。

亮点研究方法

这项工作利用病毒注射、双光子成像等技术来验证了ATP1.0在监测细胞外ATP动态变化中的可靠性。瑞沃德深耕神经科学研究领域近20年，一直致力于为客户提供可信赖的解决方案和服务，可提供这项工作中涉及的病毒注射、光纤记录以及双光子成像的完整解决方案。截止目前，瑞沃德产品及服务覆盖海内外 100 多个国家和地区，客户涵盖全 球700+医院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全 球科研人员发表SCI文章12000+，获得行业广泛认可。