线虫显微注射如何操作?超详细实验步骤快来码住
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秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是研究动物遗传、个体发育和行为活动的重要模式生物,能够研究从分子细胞水平到整体系统水平的相关生命活动的作用机理。显微注射技术使用尖 端开口直径为微米级的玻璃微管,将核酸注入线虫的性腺,进而被成熟的卵细胞吸收,以染色体外遗传物质的形式存在。而显微注射技术是线虫领域的核心技术,广泛应用于研究线虫的基因表达、功能和基因间的相互作用等。
(图片来源于摄影师马克奥-西奥卡)
实验仪器及试剂
主要仪器包括:
显微操纵器、拉制仪、注射泵、体式显微镜或倒置显微镜等。
试剂耗材包括:
琼脂糖、矿物油、带芯玻璃管、载玻片、拾取针、恢复缓冲液、OP50培养基、加样针等。
实验步骤
01、制备琼脂糖固定板
移液枪取约50μl加热溶解的2%琼脂糖溶液滴在24mm×60 mm的载玻片上,用另一载玻片轻压其上(小心气泡产生),待琼脂糖凝固后(约5分钟),将上面的玻片从侧面滑下即可。将制作好的琼脂板室温过夜或80℃干燥1小时后可叠放起来备用。
图:琼脂糖固定板的制备[1]。A. 用两条胶带将载玻片固定在干净的工作台上;B. 在载玻片中间滴一滴约50μl新鲜热熔2% 琼脂糖溶液;C. 将显微镜载玻片放在琼脂糖滴上,轻轻按下使其变平。琼脂糖凝固并取出显微镜载玻片。
02、制备注射针
注射针对于注射成功与否至关重要,使用水平拉制仪通过调节速度、拉力等参数可稳定获得两根相同的注射针,建议使用有芯玻璃管进行拉制,其芯能够使注射液迅速充满针头尖端,可以很好的排出气泡。注射针的锥度一般5-7mm,尖端0.5-0.9μm。
MP-500有着前卫智能的操作界面及加热片限位槽等人性化设计,集安全性与人性化于一体,轻松满足微电极相关实验的需求。
03、制备注射液并加入注射针
根据实验需求,选择拟注射的物质,包括DNA、RNA、蛋白质等。注射物的纯度是转入效率高低的重要影响因素之一。通过注射针的尾端,用细长的加样针将注射液灌入,等待数分钟,观察针尖有无气泡。
04、注射体积校准
将注射针装到注射泵上,吸入待注射液。在显微镜视野中心放一把微尺,上面放置一个装适量矿物油的4厘米的培养皿。将注射针浸入矿物油中,注射一次得到一个液滴球,通过微尺测量球体直径计算出注射的体积,调整注射液滴的大小使其符合所需的直径。1 nL液滴的半径为0.062 mm (V = 4/3πR3)。
瑞沃德R480玻璃微电极注射泵,注射精度高,运行稳定,密封性良好,保证注射过程不会出现漏液情况。
05、破针
将玻片放在加入注射油的琼脂垫上,移动微操使注射针与玻片边缘相撞,注射针尖端被撞破,可观察到有液泡自动渗出,该方法更易于刺入线虫体内。
06、固定线虫
一般挑选即将产卵或体内有少量卵的年轻成虫进行注射,此时期性腺发育成熟,较易被DNA 转染从而产生转基因后代。使用拾取针将线虫挑至琼脂糖固定垫上,调整位置使性腺暴露,滴加注射油覆盖整个虫体。固定操作要迅速,否则线虫容易脱水而死。
图:固定在固定板上并准备注射的线虫。箭头表示在性腺中注射首 选部位。比例尺为50μm[1]。
07、注射
将琼脂糖固定板放在载物台上,显微镜下找到线虫,调整焦距,将性腺部位聚焦在正确的平面。使用微操,将注射针尖刺入性腺。启动微量注射泵进行注射,能观察到注射液在性腺中快速流动,注射后的性腺被液体充满。
图:显示注射物注射前(1)和注射后(2)的流动。箭头标记性腺中的区域,注射物到达的位置[2]。
MM-500电动显微操纵器与显微镜配合使用,可以完成人手不能从事的精细运动的显微操作,体积小巧轻便,人性化中英文操作界面,操作起来更便捷。
08、恢复
在体视显微镜下,滴加恢复缓冲液至注射后的线虫。一般等待2-5 min,线虫活力恢复,即头部左右摇摆,身体开始游动,即可挑至培养板上,进行20℃常规培养。
瑞沃德提供MP-500程控水平电极拉制仪、MM-500电动显微操纵器、R480玻璃微电极注射泵组合方案,可对斑马鱼、线虫等胚胎、幼体进行超精细显微注射。
瑞沃德注射系统
注意事项[2]:
a.琼脂糖固定板:若线虫在琼脂糖固定板上短时间内死亡,则说明固定板过于干燥,可换琼脂糖层稍薄的固定垫,因为琼脂糖的主要作用是吸收线虫的水分;若线虫无法粘牢,则说明固定垫太湿或太薄,可继续在烘箱内放一段时间,或将线虫先粘在固定垫上后加油;
b.注射物质:注射DNA使用前要混匀并离心以避免杂质阻塞针头。注射DNA的总浓度一般控制在200mg/L以下,因为较高浓度的DNA可能产生毒性或过量表达,从而影响下一代的表型恢复;
c.注射角度:注射针与性腺最 好呈锐角,推荐与头部或尾部几乎平行或呈15℃角;
d.实验样本:被注射的线虫需要保证其食物充足,生长状态健康;
f.注射后线虫死亡率高:注射后等待恢复的时间过短或太长;可能是注射针尖太粗或注射DNA 被污染。针对此原因,可使用较细注射针,每次只注射一侧性腺,若注射操作正确,但不产生转基因线虫,则可能是转基因致死或注射核酸污染,可重新纯化。
【参考文献】
[1] Matthias Rieckher and Nektarios Tavernarakis. Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.
[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.
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- 线虫显微注射如何操作?超详细实验步骤快来码住
秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是研究动物遗传、个体发育和行为活动的重要模式生物,能够研究从分子细胞水平到整体系统水平的相关生命活动的作用机理。显微注射技术使用尖 端开口直径为微米级的玻璃微管,将核酸注入线虫的性腺,进而被成熟的卵细胞吸收,以染色体外遗传物质的形式存在。而显微注射技术是线虫领域的核心技术,广泛应用于研究线虫的基因表达、功能和基因间的相互作用等。
(图片来源于摄影师马克奥-西奥卡)
实验仪器及试剂
主要仪器包括:
显微操纵器、拉制仪、注射泵、体式显微镜或倒置显微镜等。
试剂耗材包括:
琼脂糖、矿物油、带芯玻璃管、载玻片、拾取针、恢复缓冲液、OP50培养基、加样针等。
实验步骤
01、制备琼脂糖固定板
移液枪取约50μl加热溶解的2%琼脂糖溶液滴在24mm×60 mm的载玻片上,用另一载玻片轻压其上(小心气泡产生),待琼脂糖凝固后(约5分钟),将上面的玻片从侧面滑下即可。将制作好的琼脂板室温过夜或80℃干燥1小时后可叠放起来备用。
图:琼脂糖固定板的制备[1]。A. 用两条胶带将载玻片固定在干净的工作台上;B. 在载玻片中间滴一滴约50μl新鲜热熔2% 琼脂糖溶液;C. 将显微镜载玻片放在琼脂糖滴上,轻轻按下使其变平。琼脂糖凝固并取出显微镜载玻片。
02、制备注射针
注射针对于注射成功与否至关重要,使用水平拉制仪通过调节速度、拉力等参数可稳定获得两根相同的注射针,建议使用有芯玻璃管进行拉制,其芯能够使注射液迅速充满针头尖端,可以很好的排出气泡。注射针的锥度一般5-7mm,尖端0.5-0.9μm。
MP-500有着前卫智能的操作界面及加热片限位槽等人性化设计,集安全性与人性化于一体,轻松满足微电极相关实验的需求。
03、制备注射液并加入注射针
根据实验需求,选择拟注射的物质,包括DNA、RNA、蛋白质等。注射物的纯度是转入效率高低的重要影响因素之一。通过注射针的尾端,用细长的加样针将注射液灌入,等待数分钟,观察针尖有无气泡。
04、注射体积校准
将注射针装到注射泵上,吸入待注射液。在显微镜视野中心放一把微尺,上面放置一个装适量矿物油的4厘米的培养皿。将注射针浸入矿物油中,注射一次得到一个液滴球,通过微尺测量球体直径计算出注射的体积,调整注射液滴的大小使其符合所需的直径。1 nL液滴的半径为0.062 mm (V = 4/3πR3)。
瑞沃德R480玻璃微电极注射泵,注射精度高,运行稳定,密封性良好,保证注射过程不会出现漏液情况。
05、破针
将玻片放在加入注射油的琼脂垫上,移动微操使注射针与玻片边缘相撞,注射针尖端被撞破,可观察到有液泡自动渗出,该方法更易于刺入线虫体内。
06、固定线虫
一般挑选即将产卵或体内有少量卵的年轻成虫进行注射,此时期性腺发育成熟,较易被DNA 转染从而产生转基因后代。使用拾取针将线虫挑至琼脂糖固定垫上,调整位置使性腺暴露,滴加注射油覆盖整个虫体。固定操作要迅速,否则线虫容易脱水而死。
图:固定在固定板上并准备注射的线虫。箭头表示在性腺中注射首 选部位。比例尺为50μm[1]。
07、注射
将琼脂糖固定板放在载物台上,显微镜下找到线虫,调整焦距,将性腺部位聚焦在正确的平面。使用微操,将注射针尖刺入性腺。启动微量注射泵进行注射,能观察到注射液在性腺中快速流动,注射后的性腺被液体充满。
图:显示注射物注射前(1)和注射后(2)的流动。箭头标记性腺中的区域,注射物到达的位置[2]。
MM-500电动显微操纵器与显微镜配合使用,可以完成人手不能从事的精细运动的显微操作,体积小巧轻便,人性化中英文操作界面,操作起来更便捷。
08、恢复
在体视显微镜下,滴加恢复缓冲液至注射后的线虫。一般等待2-5 min,线虫活力恢复,即头部左右摇摆,身体开始游动,即可挑至培养板上,进行20℃常规培养。
瑞沃德提供MP-500程控水平电极拉制仪、MM-500电动显微操纵器、R480玻璃微电极注射泵组合方案,可对斑马鱼、线虫等胚胎、幼体进行超精细显微注射。
瑞沃德注射系统
注意事项[2]:
a.琼脂糖固定板:若线虫在琼脂糖固定板上短时间内死亡,则说明固定板过于干燥,可换琼脂糖层稍薄的固定垫,因为琼脂糖的主要作用是吸收线虫的水分;若线虫无法粘牢,则说明固定垫太湿或太薄,可继续在烘箱内放一段时间,或将线虫先粘在固定垫上后加油;
b.注射物质:注射DNA使用前要混匀并离心以避免杂质阻塞针头。注射DNA的总浓度一般控制在200mg/L以下,因为较高浓度的DNA可能产生毒性或过量表达,从而影响下一代的表型恢复;
c.注射角度:注射针与性腺最 好呈锐角,推荐与头部或尾部几乎平行或呈15℃角;
d.实验样本:被注射的线虫需要保证其食物充足,生长状态健康;
f.注射后线虫死亡率高:注射后等待恢复的时间过短或太长;可能是注射针尖太粗或注射DNA 被污染。针对此原因,可使用较细注射针,每次只注射一侧性腺,若注射操作正确,但不产生转基因线虫,则可能是转基因致死或注射核酸污染,可重新纯化。
【参考文献】
[1] Matthias Rieckher and Nektarios Tavernarakis. Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.
[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.
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ELISA实验原理:ELISA的原理、类型及操作步骤
ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA方法类型和操作步骤
elisa可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体,②酶标记的抗原或抗体,③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。
(一)双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
(1)将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
(3)加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
(4)加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
(二)双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中,应注意钩状效应(hookeffect),类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心复合物,所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
(三)间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:
(1)将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2)加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。
(3)加酶标抗抗体:与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接dibiao记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标羊抗人IgG抗体。
(4)加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
(四)竞争法
竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下:
(1)将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体。洗涤。
(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原,保温后,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
(3)加底物显色:参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。
(五)捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在,后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法,先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下:
(1)将抗人IgM抗体连接在固相载体上,形成固相抗人IgM。洗涤。
(2)加入稀释的血清标本:保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
(3)加入特异性抗原试剂:它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
(4)加入针对特异性的酶标抗体:使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
(5)加底物显色:如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在,是为阳性反应。
(六)应用亲和素和生物素的ELISA
ELISA实验原理:ELISA的原理、类型及操作步骤!本生(天津)健康科技有限公司由具有行业背景和丰富市场经验的专业人士组成,于为生命科学研究领域提供产品,为广大科研工作者提供服务。 既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求,也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作,共创美好的未来。
- 多样品组织研磨仪原理和操作使用步骤及实验效果案例
实验室组织类样品在进行研磨前处理时,往往要将样品分成少量多批次,这样可以尽可能地满足实验检测要求,提高实验效率。为达到这样的效果,我们需要用到组织研磨机。
组织研磨机是高通量组织研磨仪搭配研磨适配器组成的,原本搭载的两个球磨罐,替换成了可装载多个离心管的研磨适配器,以实现少量多批次研磨的目标。下面上海净信就来详细介绍下组织研磨机的工作原理及操作使用步骤。
组织研磨机工作原理
组织研磨机本质上是二维振动球磨机,其工作区域有两个摇臂,运行时会做高频次的“∞”形横向水平摆动,高速运动的摇臂会带动研磨罐及罐内研磨球,赋予其动能,研磨球对样品进行撞击、挤压和摩擦,实现样品的精细研磨。
相比于常规型号的设备,组织研磨机用研磨适配器替换了研磨罐,从而可以装填更多样品。研磨适配器是类似于离心管架的容器,内部可以放置多个离心管,离心管内部可以放置样品及研磨球。设备运行时,离心管内的研磨球对样品进行撞击、摩擦和挤压,完成样品的精细研磨。
组织研磨机操作使用步骤
1、将简单处理的组织样品和适量研磨球放入离心管中,然后将装好样品的离心管放入研磨适配器中。
2、如果样品需要低温研磨,可先将装有样品的适配器放入液氮罐中冷冻降温,几分钟后取出。
3、将冷冻后的研磨适配器放在夹具中间,调整位置后利用自动中心定位的紧固装置和安全锁紧装置进行固定。
4、盖上设备仓盖,通过液晶触摸屏设置振动频率、振动时间。
5、启动设备,开始对样品进行破碎研磨,可从观察窗观察研磨平台运行情况。
6、等待研磨完成,打开仓盖,取出样品,关闭设备。
组织研磨机实验效果案例:
组织研磨对肺组织研磨效果图
组织研磨对柑橘研磨效果图
组织研磨对PCT材料研磨效果图
组织研磨对多孔材料研磨效果图
组织研磨对水凝胶研磨效果图
组织研磨对老鼠肝组织研磨效果图
以上就是对组织研磨机的工作原理和操作使用步骤的介绍,多样品组织研磨机对于动物、植物组织样品研磨、生物细胞破壁、DNA/RNA提取都有良好的处理效果,应用领域涵盖农业、食品、生物、环境等多个行业。
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