Circulation揭示：心脏纤维化与特定遗传背景的心肌成纤维细胞（CFbs）的激活有关

心肌纤维化是多种病理因素导致的心肌细胞及心肌间质的改变，可造成心脏收缩和舒张功能障碍，引起心肌功能、代谢等异常，是常见心血管疾病发生发展到某一阶段的主要病理表现。

研究表明心脏纤维化与心肌成纤维细胞（CFbs）密切相关， CFbs在心脏损伤反应中发挥着重要作用，但由于遗传背景多样性和心脏成纤维细胞的异质性阻碍了CFbs对调节心脏纤维化的分子机制的研究。

2018年发表在顶级心血管杂志Circulation上的文献Genetic Regulation of Fibroblast Activation and Proliferation in Cardiac Fibrosis，作者采用杂交小鼠多样性组(HMDP)来探究遗传多样性的心肌成纤维细胞及其在纤维化中的作用，揭示了遗传背景特异性会影响心功能障碍和病理性纤维化的发展进程，并验证心肌成纤维化细胞的激活对于心肌纤维化程度的贡献，同时发现了心肌纤维化的潜在标记基因。

异丙肾上腺素(isoproterol, ISO)是一种非选择性-肾上腺素能激动剂，被广泛用于诱发小鼠心脏损伤、心肌肥大、纤维化等模型。之前的研究表明，异丙肾上腺素处理后的杂交小鼠多样性组各品系间的心脏病理生理学和纤维化表现出显著性差异。基于这种差异性，本文作者选择了三种具有代表性的小鼠品系:C57BL/6J、C3H/HeJ和KK/HIJ（它们分别在ISO处理后表现出轻度、中度和最严重的心肌纤维化（图1A））进行研究，通过腹腔植入缓释泵进行ISO慢性给药，ISO剂量30mg/kg /d，持续21天构建心肌纤维化模型。

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通过渗透泵释放ISO已是常用的造模手段，此方式构建的慢性心肌纤维化模型具备稳定、重复性好的特点，可模拟人类晚期心力衰竭的病理特征。

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作者首先对这三种不同遗传背景的小鼠进行ISO诱导后的心功能和纤维化的病理分析，心脏组织切片Masson三色染色显示，ISO处理后，C3H/HeJ和KK/HlJ品系小鼠心脏均表现出清晰的纤维化区域(蓝色)，而C57BL/6J心肌纤维化面积最小（图1B），进一步的功能超声心动图分析显示C3H/HeJ和KK/HlJ品系的射血分数（EF）显著降低，相比之下，ISO处理的C57BL/6J小鼠心功能基本没受到损害（图1D），实验结果证实了慢性ISO刺激不同品系小鼠会导致不同程度的心肌纤维化。

图1. ISO处理后不同品系(C57BL/6J, C3H/HeJ, KK/HIJ)的心肌纤维化程度不同

基于上述三种品系所表现出的不同程度的纤维化模式，作者接下来通过体内外实验重点研究不同品系小鼠的心肌成纤维细胞在心肌纤维化模式中的潜在作用。首先是体外细胞实验，从三种品系小鼠得到的原代心肌成纤维细胞经过分选，扩增，传代，并暴露于ISO 72小时之后，作者试图确定这三种品系小鼠的CFbs是否表现出类似的激活和增殖模式。胶原蛋白1 (Col1)、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)和磷酸化组蛋白H3 (pHH3)分别用于心肌纤维细胞、细胞活化和增殖的标记。细胞染色可以发现ISO处理后，来自C3H/HeJ和KK/HlJ这两个品系的CFbs有很大比率共表达αSMA和Col1，而来自C57BL/6J 的CFbs的αSMA表达量最小，pHH3的细胞染色则显示三种品系的CFbs增殖水平类似（图2B、C、E）。这些体外实验数据表明，CFbs以小鼠品系特异性的方式响应ISO，ISO处理不同品系的CFbs会导致不同的激活水平，但品系间CFbs的增殖水平没有显著性差异。

图2. 体外ISO处理后小鼠品系的特异性影响CFbs的激活和增殖方式

作者接着进行体内实验验证，免疫组织化学染色结果表明，ISO处理后，许多Col1+细胞在C3H/HeJ和KK/HlJ心肌的血管周和间质区共表达αSMA，并且CFbs激活水平与各品系小鼠的纤维化程度相对应（图3A、B）；采用BrdU染色标记增殖细胞，在ISO处理后，可以观察到血管周围和间质中BrdU+/CFbs细胞的数量显著增加，且三种品系增殖的数量相近，具备相似的CFbs增殖模式（图3D、E），与体外结果一致。以上体内外实验结果表明，心肌病理纤维化程度直接与CFbs的活化水平相关，而不是CFbs增殖水平有关。

图3. 体内ISO处理后小鼠品系的特异性影响CFbs的激活和增殖方式

为了进一步阐述CFbs对于纤维化的内在机制，作者接下来对经ISO处理的这三种品系小鼠的CFbs进行转录组测序。从差异基因表达的热图数据（图4A）可以看出ISO对各品系小鼠的CFbs转录组的影响是独特的。另外，对比心肌纤维化以及增殖相关的基因可以发现，KK/HIJ品系中CFbs的激活和纤维化相关的基因与C3H/HeJ和C57BL/6J 品系相比高度上调（图4B），而这三个品系中与细胞周期和增殖相关的基因的表达水平相似（图4C）。以上结果进一步验证心肌纤维化进程中CFBs的激活和增殖不是相互包容的，CFbs增殖可能是CFbs激活的独立反应，不应将CFbs的增殖作为心脏纤维化程度的测量标准。

图4. ISO处理可诱导不同品系小鼠CFbs的特异基因表达模式

最后，作者试图在不同遗传背景的小鼠品系中识别出与纤维化相关的共有特定基因作为纤维化的标志物。作者聚焦于ISO处理后每个品系都上调的基因，可以观察到绝大多数上调的基因对每个品系都是独特，而三者共同上调的重叠基因仅有9个（图5A），并最终锁定其中的LTBP2（图5B）。作者对LTBP2进行RT-qPCR实验证实了其与转录组测序数据相同的增长趋势（图5C）。同时为了进一步证实LTBP2蛋白在纤维化中存在，对ISO处理后的心脏切片进行免疫组化，可以观察到 LTBP2与成纤维细胞标记物DDR2和αSMA共同定位，LTBP2的表达特异性地定位于纤维化区域，即使在心肌纤维化程度最小的C57BL/6J小鼠中也是如此（图5D）。实验结果提示LTBP2的表达可能指示了心肌纤维化的发展，但其在纤维化中的具体作用还有待进一步研究。

图5. 所有品系小鼠心肌纤维化后CFbs中的Ltbp2均上调

总之，本研究作者通过使用多个近交系小鼠品系来描述CFbs及其对ISO处理后的反应，强调了遗传背景特异性对于心肌纤维化的重要性。体内外实验表明CFbs的激活，而不是增殖，与心肌纤维化严重程度密切相关。此外，通过比较多个品系的CFbs转录组，作者确定了LTBP2基因作为纤维化的标志物，该基因与心肌纤维化密切相关，并指出可将其及其信号通路作为心肌纤维化的潜在治疗靶点。