荧光寿命成像助力攻克癌症热点靶标——四链DNA结构

1953年，科学家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克发现了DNA分子的双螺旋结构，遗传学的研究进入到分子层次，人们可以更深层的了解遗传信息的构成和传递途径（图1A）。近年，科学家在人类癌症细胞中发现一种四重螺旋体DNA分子——G-四链体(G-quadruplex)。它是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四分体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体（图1B）。

有研究表明，G-四链体更多的出现在癌细胞等快速分裂的细胞中，与癌基因的启动子区域和DNA链的端粒区域相互作用。因此，G-四链体结构与DNA复制过程有着紧密联系，对于细胞分裂和增殖非常关键[1]。那么，通过靶向调控G-四链体结构将有望成为选择性YZ癌细胞增殖的新途径，G-四链体也成为了癌症ZL药物的重要靶标。

图1.A：James Dewey Waston（左）& Francis Harry Compton Crick（右）

B：G4-DNA的3D结构

鉴于G4-DNA参与到很多生物过程当中，开发用于检测和可视化细胞中 G4-DNA 结构的工具也尤为重要。伦敦帝国理工学院的研究人员开发了一种能够在活细胞中检测G4-DNA的荧光探针——DAOTA-M2，为人们揭开了这种结构的神秘面纱 [2]。

这种探针具备良好的活细胞渗透性和低细胞毒性，在与G4-DNA结合时会发出荧光，可以用来观察G4-DNA是如何与活细胞内的其他分子相互作用的。并且当DAOTA-M2与不同的核酸拓扑结构结合时，将显示出不同的荧光寿命信息，进而可以区别双螺旋DNA和G4 DNA（图2），因为与四链体结合时荧光寿命更长（图3）。

图2. 荧光寿命置换测定的示意图：竞争对手结合后，DAOTA-M2 从 G4-DNA 转移到 dsDNA环境，导致其荧光寿命缩短

图3 DAOTA-M2染色的活细胞U2OS细胞核DNA的FLIM分析（a）以 512 × 512 分辨率（λex=477 nm，λem=550–700 nm）记录的荧光强度图像，红线表示用于 FLIM 分析的核分割（b） 来自 a 的 FLIM 图，显示在平均寿命 (τw) 9ns（红色）和 13ns（蓝色）之间（c） 平均核强度与平均核寿命（蓝点）的二维相关性（d）单个原子核的放大 FLIM 图 - 颜色代表寿命，由 9ns（红色）和 13ns（蓝色）之间的颜色梯度条定义

G4-DNA的生物功能是通过动态的折叠和打开实现。在细胞内，G4-DNA可以自发折叠，但其打开是由专门的解旋酶来完成。并且在接下来的研究中，科学家发现哺乳类动物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表达量减少将会导致DAOTA-M2荧光寿命变长（图4）[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2荧光寿命的变化监测G4-DNA在活细胞中的动态变化。

图4，减少 FancJ或RTEL1 解旋酶表达如何导致更长的 DAOTA-M2 寿命 (τw)的示意图

G4-DNA被认为是潜在癌症ZL药物靶点，因此评估给定的 G4-DNA靶向药物与该结构结合的能力将非常有用。通过不同处理后DAOTA-M2的荧光寿命变化，结果显示双羧酸功能化的Ni（Ni-salphen）与G4-DNA有很强的靶向结合能力，会在短时间内导致DAOTA-M2荧光寿命迅速下降。（图5）

图5. 加入结合剂1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像结果（显示在 6ns（红色）和 14ns（蓝色）之间）共孵育后 使用 DMSO（对照）、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺：20 μm

在以上的科研工作中，不难发现，JZ的检测方法是必不可少的，比如贯穿于整篇文献中的FLIM技术。FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，荧光寿命成像）：是一种基于荧光寿命的显微成像技术，其成像结果提供像素位点的寿命信息，使得我们在荧光强度成像之外，能更加深入地对样品进行功能性测量。荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点，如不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响。会因为分子构象、分子间相互作用、分子微环境、生理状态等条件改变而发生变化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON荧光寿命成像系统，搭载新一代白激光（440-790nm）以及HyD X高灵敏度专用检测器，提供超快速、多维度荧光寿命成像解决方案。

将特异性探针与FLIM相结合使用，不仅可以用来监测活细胞细胞核中G4-DNA的形成，以及判定小分子药物与G4-DNA的相互作用，还可以应用于G4-DNA靶向药物的筛选。这些信息将为癌症的诊断和ZL带来了新启示，更有助于靶向性新疗法新药物的开发。

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