naica®微滴芯片数字PCR系统三色多重分析设计性能优化指

多重分析，即在单个反应中检测多个靶标，可以帮助用户节省宝贵的样品，并节省时间、试剂和成本。此外，和做多次单重实验相比，由于多重反应所有靶标都在同一个反应中进行扩增和检测，使得样品和试剂的移液操作误差减少，因此多重检测可以提高定量精度。naica®微滴芯片数字PCR系统的多重检测与单重检测一样灵敏和JZ。专业的分析设计和优化可以实现更复杂的多重检测，从而在单个PCR反应中用多对引物和探针扩增多个DNA目标。Crystal Miner软件是一个开放的数据分析软件，可以通过其提供的强大工具来帮助优化和完成多重分析。

评估引物和探针性能的实验指南

1.Stilla建议使用naica® multiplex PCR mix，该试剂设计的初衷是为了得到更好的多重naica®微滴芯片数字PCR系统的实验数据。

2.单重反应测试。在进行多重反应之前，每个引物/探针/模板均需要进行单重性能验证。例如，对于三重分析，在多重反应混合进行之前，首先应对核酸靶标进行三个单重反应。当进行单重反应时，预期结果只出现单一阳性。

3.为了优化多重分析性能，样品性质也是十分重要的因素(例如，游离DNA和基因组DNA需要设计不同的DNA片段，分析游离DNA需要设计成短片段DNA，分析基因组DNA需要设计更完整的DNA片段)。

4.使用的DNA模板应该没有污染物和可能的YZ剂。如果样品材料稀少或不容易获得，可以合成寡核苷酸作为模板分析优化。

5. 评估每个单重反应的退火温度范围，在ZJ反应温度下，阳性和阴性微滴分离良好且没有非特异性扩增(图1)。由Crystal Miner软件(图2)提供的Stilla可分离评价可以作为一种度量标准，用于确定所有探针的ZJ退火温度。如果单重反应没有被很好地优化，可能会出现明显的非特异性扩增。此外，非特异性扩增可能由几个非优化参数造成。包括引物/探针二聚体或引物/探针非特异性。在这种情况下，可以采用多种方法限制非特异性序列的扩增，如提高退火温度、进行touch down PCR或重新设计引物序列等。实验前可使用相关软件评估引物探针的特异性。

▲图1 ：Crystal Miner软件展示单重反应一维点状图，在60°C到65°C退火温度内， 蓝色、绿色和红色荧光通道检测到的荧光强度。黑框部分表示单重反应的ZJ退火温度。可分性评分(e)可用于确定3个靶标扩增的ZJ退火温度。(带*数字为可分性评分)

▲图2 ：可分性评分是基于阳性和阴性微滴群体的距离。可分性评分是

由Crystal Miner软件自动计算，并可以在高级QC标签栏下找到。

6.在选定的退火温度下，使用所有引物和探针进行多重naica®微滴芯片数字PCR系统，并以区分度为指导，评估反应性能。如果有需要，可从以下几点优化:

★ 调整PCR的循环数——建议从45个循环开始，并增加循环数，以进一步优化阳性和阴性微滴群体之间的分离度。

★ 调整引物和探针浓度——naica®微滴芯片数字PCR系统推荐的引物和探针浓度范围可从0.125到1μM (图3)。对于多重分析的设计建议从较低的浓度范围开始,以减少反应的复杂性,减少引物和探针所占据的体积。

▲图3。Crystal Miner软件的一维点状图显示了一系列引物(左图)和探针(右图)

浓度不断增加时蓝色检测通道中的荧光强度。黑框部分表示良好的可分性评分，

及在低引物探针浓度的选择标准下确定的用于多重分析的引物探针浓度。(带*数字为可分性评分)

★ 使用修饰的碱基，如锁核苷酸(LNA)碱基或小沟结合基团(MGB)，以提高探针的Tm值，同时保持较短的长度(可能<20nt)。然而，在多重检测中建议探针添加的MGB不超过2个，以避免扩增减少。

7.评价引物和探针的相互作用：在同一个多重实验中引物和/或探针之间形成同源/异源二聚体的概率应保持在ZD。二聚体是可以评估的，相互作用的分数可以用多种工具来确定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (图4)。高浓度的引物和探针会增加非特异性相互作用的概率。因此，多重分析时，建议所有检测都从低浓度的引物开始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加浓度至1 uM(例如，提高扩增效率)。

▲图4：引物和探针之间的相互作用示例。a)target 1的探针与target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，红框)。当使用反向引物RI target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，应选择RI target 2进行多重检测。b) target 1的探针与target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 蓝框)。当使用正向引物F1 target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，FI target 2应被选择用于多重检测。

8.对于多重分析，荧光溢出补偿是十分重要的。使用多个单色参照，Crystal Miner软件可以创建一个补偿模型用于特定的多重反应。

naica®微滴芯片数字PCR系统

naica®微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行JD定量。2.5小时内，可快速获得结果。