技术干货 | 三血管阻塞模型的制作

//三血管阻塞模型

急性脑缺血动物模型是研究脑血管病病理机制和FZ措施不可缺少的工具。由于临床上缺血性卒中大多是由于大脑中动脉区域梗死造成，因此人们普通采用血管内线栓法模型，但是由于该模型制作变异性大，而且动物长期存活率低，致使实验重复性差。

后来经过学者们不断的摸索优化，发明了开颅后夹闭大脑中动脉(而非电凝)联合双侧颈总动脉夹闭的大鼠三血管阻塞模型(3-vessel occlusion， 3-VO) ，由于该方法可同时导致大鼠皮质和基底节缺血，被认为是最接近人类卒中的标准动物模型，适用于脑缺血后长期神经功能缺失的康复及介入ZL研究中。另外，该模型因其缺血较为迅速、缺血效果好、再灌注血流恢复迅速而更加适用于急性缺血性疾病的研究。

//动物选择

•小鼠：C57BL6J  CD-1等小鼠，常用雄性小鼠，体重25-35g

•大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar等多种小鼠，常用雄性大鼠，体重250~350g

//制作步骤

1.大鼠手术操作步骤

•将大鼠置于手术台上,取仰卧位,用10m注射器大小的管子放置在大鼠颈后,以加强双侧颈总动脉的显露。

(1)剃掉颈部和腹侧的毛,用75%的乙醇棉球或聚维酮碘进行局部皮肤消毒,颈部中线做一个切口,分离双侧颈总动脉,双动脉下穿线;分离颈总动脉时小心分离伴行的迷走神经纤维,以免受损伤。

(3)将大鼠体位改为左侧卧位。

(4)在大鼠右眼滴加1~2滴人工泪液,闭上眼睑,避免手术中对眼睛造成损伤;剃掉右侧外耳道和右眼外之间的皮毛,使用聚维酮碘局部皮肤消毒,75%乙醇脱碘,在两个位置连线中点做一切口,长度约2cm。

(5)用止血钳拉开切口,切断颞肌,分离肌肉,暴露颧弓。操作工程中要注意保护腮腺和面神经。

(6)用咬骨钳移除颧弓,用牵张器撑开下颌骨与颧弓,暴露前庭窗;用1.4mm钻头的骨钻在前庭窗的前3mm、下1mm处钻孔,钻头浸在室温的盐水中,以免在钻洞过程中造成皮质热或物理损伤。在显微镜下透过硬脑膜即可看见大脑中动脉,垂直于嗅束向上走行。

(7)用针头挑破硬脑膜,分离大脑中动脉周围的蛛网膜,暴露大脑中动脉。用显微镊在接近嗅束处将大脑中动脉挑起,用无创微动脉夹夹闭或尼龙线结扎大脑中动脉,夹闭结扎位置在其分支豆纹动脉之前或靠近颈内动脉处。将颞肌和表面皮肤覆盖回位,用浸透人造脑脊液的纱布覆盖。

(8)在阻断大脑中动脉同时,通过尼龙线套扣阻断双侧颈总动脉的血流(见图1和图2)。

(9)缺血1~2h后颈总动脉的动脉瘤夹/缝线和大脑中动脉的缝线都被松开,在显微镜下直接观察3个动脉血流的恢复。

 (10)再灌注20min后,用牙科胶泥封闭颅骨手术,再分别缝合切口。允许大鼠麻醉苏醒后自由进食水。所有大鼠在能通风换气的(24±0.5)℃孵箱中直到实验结束。

图1三血管阻塞模型操作步骤

(a)  在左侧眼外眦至外耳道之间做长约2cm的切口;(b)暴露颞肌,纯性分离并牵开颞肌；(c)以卵圆窝或者下领神经前方3cm、侧方1cm的鳞骨为ZX，钻一直径为2~4mm的小孔；(d)移去颅骨；(e)暴露大脑中动脉区域；(f)剪开需扎闭区域周围硬脑膜，用10-0或11-0的带针缝合线结；大脑中动脉；(g)手术示意图；(h)结扎双侧颈总动脉。

图2三血管结扎示意图

注:双侧颈总动脉、右侧大脑中动脉结扎造成大脑中动脉区域持续、稳定的缺血

2.小鼠手术操作步骤

小鼠的手术操作流程与大鼠基本相同，不同之处是用更小的动静脉畸形血管夹。

//注意事项及常见问题解答

1.注意事项

•麻醉剂对梗死体积的作用

在麻醉和手术过程中对大脑缺血模型都是有影响的。麻醉剂在大脑缺血的病理生理中有重要作用。因此,笔者比较了不同麻醉剂对缺血梗死体积的影响,发现水合氯醛是这模型的理想麻醉剂。

水合氯醛是镇静剂，用于ZL失眠的短效药物，可缓解焦虑，在手术前诱导睡眠或ZL乙醇戒断症状，也可用于术后缓解疼痛。用水合氯醛比用其他的麻醉药(如氯 胺 酮、赛拉嗪、乙 醚和异氟醚)模型的梗死体积和结扎时间有更好的相关性。水合氯醛的另一优点在于不是管制药品,在购买和存放时减少了很多限制要求。

•血糖对梗死体积的影响

在临床研究中发现，血糖水平是缺血脑损伤一个主要的决定因素。三血管MCAO模型也证实血糖水平对缺血结果有重要影响。高血糖导致梗死体积明显增大，并且高血糖是缺血期间最有害的因素，反之低血糖则能减少梗死体积。在ZL窗内使血糖恢复正常能有效减少梗死体积。

然而，血糖对脑缺血作用的分子机制还不清楚。缺血前禁食24h能减少缺血24h后的脑损伤,这一作用持续至再灌注后28d。尽管COX-1基因ZL能在缺血24h后减少大脑梗死体积，但是在再灌注后的28d未见其持续的保护作用。这些结果均表明血糖对缺血脑损伤有重要作用,且是评价缺血的远期预后的一个重要因素。

•脑水肿对梗死体积的影响

在局灶性脑缺血的动物模型中，通过特殊组织染色观察每一个脑片的梗死部位，通常通过测量这些梗死面积来确定梗死体积。

形态学测定分析梗死体积是一个客观并且定量的评估缺血脑损伤程度的方法，同时这种方法在临床前的研究中常被用于判断神经保护剂的有效性。然而，肿胀的缺血组织可能导致测得的梗死区域增大，因此高估了实际的梗死体积。把脑水肿包括在梗死体积内计算可使实际的梗死体积增加多达22%。

因此，因脑水肿引起的梗死体积失真可能使得干预ZL的有效与否难以解释。可通过测量皮质的水含量和MRI确定在这一模型缺血损伤后的1~3d脑水肿的严重程度来减少因脑水肿导致的误差，Swanson等提出了一种基于正常存活的灰质体积来计算梗死体积的方法，这一方法进一步被林等证实。

显然，以前直接测量梗死体积的方法在缺血后前3d脑水肿进展期间所测得的数据要高于实际梗死体积，这一误差能通过基于对非梗死皮质体积的间接测量得以减少。

•性别对梗死体积的影响

流行病学研究发现，女性(直至绝经后,即55岁后)心血管病的患病率低于男性，卒中的发病率也是如此。有短暂性缺血发作或小卒中的女性发病率低于男性。动物研究也表明性别不同，卒中的结果不同。在三血管MCAO模型中，雄性比雌性大鼠的梗死体积更大。当在三血管MCAO模型中混有雄性和雌性大鼠时，应该考虑性别的影响。

•温度对梗死体积的影响

研究发现，即使是轻微的大脑温度降低，也能对缺血损伤的大脑起到保护作用。Connolly等的研究显示，MCAO模型后，小鼠无法自我调节体温，在保护期出现严重的低温，而这种体温变化对MCAO模型后病理结果有显著的影响，是损伤了下丘脑体温调节中 枢所致。

2.常见问题及解决方法

•梗死面积太小

在该模型中，选择截断大脑中动脉主干血流的部分十分重要。实践经验认为只有在鼻裂间隙正上段部位的血流阻断才能得到相对合适的梗死范围。

•损伤脑组织或出血

在手术阻断大脑中动脉主干时，电凝或结扎该血管都很容易造成邻近此血管的脑组织损伤，如果电凝不到位或结扎过于用力，或手术操作粗暴，都极易损伤大脑中动脉主干，从而导致大出血，使手术失败。

*以上内容部分源自《实验卒中模型方法学》

书号：ISBN 978-7-313-21776-9

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