抗体药物偶联物(ADC)的DAR分析表征

抗体-药物偶联物（ADC）作为一种生物ZL候选药物是近年来的研究热点。ADC药物是将单克隆抗体的肿瘤特异性和靶向性与GX的小分子药物的细胞毒性结合成一个新的药物分子，从而形成有效的kang癌ZL剂。这些分子由三部分组成：单克隆抗体、稳定的连接物以及细胞毒性小分子药物。

ADC药物的药效和清除率都与药物抗体偶联比（DAR）值有关，因此在药物开发过程中必须对其精确分析。尺寸排阻色谱法和疏水色谱法是在天然生理条件下检测DAR的两种最常用的方法。

在本应用中，我们通过SEC-MS和HIC-UV法来对一个半胱氨酸偶联的ADC药物模拟物进行分析。该模拟物是由LC-SMCC交联剂将丹磺酰基萤光团共价键合到IgG1-mAb上，形成一个载药量不同（0-8）的抗体混合物。

图1. 半胱氨酸偶联的ADC模拟物

图2. 半胱氨酸偶联的ADC的异质性

实验部分

在SEC-MS方法中，我们选用TSKgel SuperSW3000尺寸排阻色谱柱。将ADC注入该色谱柱中，HPLC系统与质谱相连，用于检测DAR谱图。从谱图中观察到，每个主峰之间的分子量差异为1336 Da，对应两个丹磺酰基荧光团分子的分子量。SEC/MS分析表明，平均DAR为3.9 。

图3. ADC模拟物的SEC/MS谱图

然后，使用疏水色谱柱TSKgel Butyl-NPR和UV检测，来确认DAR分布情况。mAb抗体结合的药物分子数越多，ADC的疏水性越大，在HIC固定相上的保留时间更长，载药量不同的组分便可得到分离。从DAR谱图中可以看到，DAR=0-8的各峰之间分离情况很好。

图4. ADC模拟物的HIC-UV谱图

结果与讨论

SEC-MS和HIC-UV是有效表征ADC的DAR谱图的两种方法。在TSKgel SuperSW3000色谱柱上，使用了质谱兼容的流动相，通过高分辨率ESI-MS检测，验证药物模拟物中ADC组分的分子量。

HIC-UV方法中，使用TSKgel Butyl-NPR色谱柱对样品中各种抗体-载荷的ADC异构体进行疏水性分析，进一步确认其DAR分布。结合这两种分析方法，可以有效验证ADC生物大分子的DAR谱图。

对微纳器件进行表征时，常关注的便是器件的表面形貌和三维尺寸信息，比如粗糙度、深度、体积等，这些都是评价微纳加工工艺的重要指标。然而，在进行表面三维的分析工作中，我们可能常遇到这样的苦恼：

　　光学明场无法直接定位到亚微米级缺陷结构!

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　　▲ 不同观察方式下晶圆表面缺陷

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　　▲共聚焦三维图像及深度测量

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利用ACE键合相的固定相选择

分离度方程式可以确定影响分离度的参数：柱效（N）、容量因子（k）和选择性（α）。

在过去几年里，柱效和使用超GX色谱柱（被称为“UHPLC”色谱柱）作为实现分离目标的手段已得到了极大的重视。

UHPLC已通过更快速的分离和更快速的方法开发提高实验室生产力来证明了其价值。

然而，选择性往往被忽视，且其重要性也被强调柱效所掩盖。这是令人遗憾的。

在影响分离度的三个参数中，选择性是Z为重要的。

（参见图1）通过利用柱效和选择性，通常可以实现更好和更快的分离。

图 1：N、α和k对分离度（Rs）的影响

提高N，α或k可以提高分离度（Rs）。

然而，从这些图中可以看出，随着N或k值的提高，对分离度的改善效果也逐渐降低。

另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

在反相色谱中，固定相与分析物之间存在多种相互作用的机制，这可以用来实现分离。

这些相互作用机制包括：疏水性结合、π-π、氢键、偶极-偶极和形状选择性。

不同类型的键合相将提供其中一种或多种相互作用机制。表1列出了ACE键合相和每种可能的主要相互作用机制，这取决于分析物和流动相条件。

表1: 比较不同键合相的分离机制/相互作用                                                                                    

利用键合相的选择性实现更好的分离。
图2表明了两种ACE键合相即C18-AR与苯基之间的选择性差异。
尽管两种键合相提供了强π-π和偶极-偶极相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用机制（特别是疏水性结合）的强度方面，它们存在显著差异。

C18-AR可能具有其它不同的分离机制，可以为复杂的混合物带来更好的分离效果。对于其他混合物，可能不是这种情况，这是ACE键合相的优势。

当开发分离方法时，ACE键合相可以提供各种可供选择的重要保留机制。

非常强大且独特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色谱柱中可以获得。
通过利用柱效和选择性，可以实现更好的分离。

图 2：C18-AR与苯基相之间选择性差异的比较

色谱柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流动相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
温度： 60 ℃
检测： UV 214 nm
梯度： 5分钟内从3至B，并持续1分钟。

样品：
1. 甲硝唑
2. 3-羟基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水杨酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎宁
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡罗昔康
16. 卡维地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，这可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的选择性。还要注意C18-AR与苯基相的洗脱顺序有很多变化。

图3给出了键合相选择能力的另一实例。

一个分离是用C18键合相的UHPLC色谱柱完成，另一个分离是用C18-PFP键合相的UHPLC色谱柱完成。

C18-PFP键合相提供的额外分离机制，使得总体分离效果更佳出色。

图 3：ACE Excel可以获得zhuo越的分离度和峰形：药物及其相关物质的UHPLC结果

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
流动相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分钟内从3至B
流速：0.6 mL/min
温度：40 ℃
检测：UV 254 nm

样品
1. 对乙酰氨基酚
2. 氢氯噻嗪
3. 甲基苯基亚砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色谱柱和C18-PFP色谱柱上同样快速地产生色谱图。

然而，C18-PFP色谱柱可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更佳的选择性，因此能够提供优越的总体分离性能。