客户案例｜辉瑞在多个实验室同时部署MAM

引言

Multi-Attribute Method(MAM)这一概念于2015年首见于发表文献中¹，由Richard Rogers等人共同提出，引起了生物制药界的广泛关注，在国际范围内的学术会议/论坛中始终处于生物制药策略相关对话的焦点位置。

作为一种基于肽图分析的工作流程，得益于GX液相色谱-超高分辨质谱联用平台，MAM能够同时提供多个产品质量属性（product quality attributes, PQAs）的相对定量结果，兼具高分辨率、高质量精度与高灵敏度，使得复杂基质中的低含量修饰组分也可获得高度可信的定量结果，从而帮助研究人员对PQAs更加深入的理解并优化生产工艺流程²。与此同时，系统良好的稳健性与重现性为跨实验室部署MAM提供了可能。

图1 MAM工作流程示意图

客户案例分享：

辉瑞制药

建设面向未来的MAM实验室

作为zui大的以研发为基础的生物制药公司，创新是改善健康状况并保持辉瑞持续增长和收益的关键所在。辉瑞致力于为世界提供高品质的健康产品，并产出超越所有利益相关者所期待的高品质结果。为支持公司的研究目标，质谱与生物物理表征组（Mass Spectrometry and Biophysical Characterization, MSBC group）的任务之一就是以开放、协作和及时的方式使用领先的表征策略、zui先进的仪器和创新的分析方法，阐明生物ZL药物的分子结构并ZZ助力药物的研发和商业化。因此，MAM工作流程进入了MSBC组的视野。

辉瑞在位于两个不同地点的实验室同时部署了MAM

如前文所述，对于多个PQA，MAM工作流程能够同时进行特定修饰位点的发现、鉴定、定量和监控。 与可能无法提供特定修饰位点信息的传统检验方法相比，MAM可以直接为PQA提供定量评估结果，从而增强了研究人员对于过程和产品的理解。 对于辉瑞而言，他们的目标是在新产品开发伊始最初的表征阶段之后便通过MAM对各种样品进行PQA监控、指导过程开发和结构功能研究，并ZZ控制策略和规范设置。

因此，辉瑞公司成立了专门的团队并实施了一个多站点MAM“未来实验室”简化PQA分析。

辉瑞的MAM历程

辉瑞的MAM团队在抗体药物临床前早期研发阶段就会引入MAM工作流程，对未施加压力条件/加速压力条件的原料药进行深度表征，对比所有预期/非预期的翻译后修饰和化学修饰的变化。基于赛默飞所提供的仪器和软件平台，MSBC组可以为每个产品建立全面的关键PQA工作列表，并转移至后续的PPL生化/分离组（Project Progression Lines（PPL）biochemistry/separation science groups）用于PQA监控。因此，他们期望MAM能够为PPL组提供额外的功能，以更广泛的矩阵形式来监控具有位点特异性的多种属性，同时作为潜在的、可信的放行/稳定性/鉴定和/或简化工作流程以提GX率。

另外，辉瑞MAM团队还将此工作流程用于与生产工艺改进和不同实验室间变更相关的可比性研究实操。对于MSBC组和PPL生化/分离组而言，组内MAM的培训和方法转移是他们的短期目标。放眼长远，仪器和软件的日趋成熟与直观性增强，对非质谱背景的操作人员更加友好，使得将MAM完全整合至质量控制（quality control, QC）实验室、制剂团队和GMP 生产车间成为可能。

辉瑞将MAM引入分析过程中可以获得的关键得益如下：

1、MAM是基于LC-MS平台的一体化流程，可以同时对多个PQA进行分析，提供位点特异性的信息，可在日常分析中有效补充鉴定、放行和稳定性相关信息（图2）。

2、MAM允许对已知PQA自动监控和定量，并且能够对过程和产品开发中出现的新峰进行检测，有助于建立针对产品特异性的、规章制度化的和整体的科学知识。

图2 基于MAM同时对多个PQA进行分析，获得位点特异性的信息。

辉瑞对MAM的发展

如图3所示，MAM包括数个必须要素。工作流程以快速酶解开始（通常使用胰酶），能够保持样品的翻译后修饰（如N/O-糖基化修饰，唾液酸等），并zui大程度上减少酶解过程所引入的修饰（例如温度/pH所导致的脱酰胺和氧化等）。MSBC组对产品进行深度表征，获得位点特异性的PQA列表后，将该列表转移至PPL组，随后PPL组将此列表导入变色龙中，并使用LC-MS only的策略对PQA进行日常监控。色谱高度重现的保留时间、质谱的高分辨率/高质量精度以及同位素峰分布信息使得基于一级质谱信息来自动对库中的PQA鉴定并定量成为可能。

图3 辉瑞的MAM工作流程示意图。MSBC 组进行初始的LC-MS/MS表征并确定位点特异性的PQA列表。随后PPL组使用该列表，通过LC-MS方法进行PQA的日常监控。

在选择PQA进行监控和定量时，如何将PQA数目控制在合理范围内，以确保监控过程的快速与可信显得尤为重要。因此，在实验的初筛阶段建立PQA列表时，可以先选择一些广为人知的PQA，例如N-糖基化、N-/C-末端修饰和其他常见修饰，如天冬酰胺脱酰胺、天冬氨酸异构化和甲硫氨酸/色氨酸氧化等，以监控可能的降解。随着研究过程的深入，由于对产品有了更加全面的了解，可以将更多PQA添加至初筛得到的PQA列表中，从而保证对产品一致性的全面监控。得益于变色龙软件的灵活性，PQA列表的实时更新非常容易实现。

系统的稳定性与重现性是保证MAM能够获得长期成功的关键要素之一。目前赛默飞官方建议的系统稳定性评估是使用商品化的BSA酶解肽段标准品进行系统稳定性测试。与使用合成肽段标准品进行系统稳定性评估相比，虽然合成肽段标准品能够对MAM的几个关键要素，例如色谱保留时间、色谱峰型/峰宽，质谱质量精确度进行评估，除此之外BSA酶解肽段标准品还能提供额外的属性用于监控，例如样品前处理引入的化学修饰比例和源内裂解等。将BSA酶解肽段标准品作为系统稳定性测试的标准品，可以从仪器装机开始便一直用同一套标准评判系统表现与稳定性。

辉瑞同样也选择了一个内部生产的单抗标准品用于MAM应用的日间稳定性监控。选用此标准品的意义在于，可以在BSA酶解肽段标准品的基础上对酶解的稳健性进行评估。

来自于辉瑞的MAM实际应用案例

在最近的一次网络讲座(Understanding Biotherapeutic Product Quality Attributes through a Multi-Attribute Method (MAM) Lab-of-the-Future, available on-demand)中，辉瑞MAM团队首席科学家Andrew Dawdy介绍了MAM工作流程的部分实际应用案例。

案例一

N-糖型定量：传统2-AB标记法与MAM 的对比

在此案例中，研究团队选择了三批来自不同生物反应器的样品，分别采用糖苷酶切除糖链，随后使用2-AB标记并检测的传统方法，和MAM对N-糖肽进行相对定量结果进行对比。如图4所示，对于主要/次要/痕量级糖型，MAM（蓝色柱状图）与传统方法（黑/灰色柱状图）的定量结果高度吻合。

图4 MAM与传统2-AB标记-HILIC-FLR法对来源于三个不同生物反应器样品的N-糖型定量结果对比。两种方法对主要/次要/痕量糖型的定量结果高度吻合。

案例二

通过MAM鉴定电荷变异体并精确定位至修饰位点

在强制降解研究中，将某单抗产品在40℃下孵育18周，随后分别使用成像毛细管电泳（imaged capillary electrophoresis, iCE ）和MAM对其进行电荷变异体分析。两种不同分析方法的结果高度相似。然而，iCE能够提供的是全局层面的电荷变异体信息，意味着无法得到鉴定信息，或是将导致电荷异质性的因素细化到某一特定位点上；与此相反，对于每个酸性变异体相关的PQA，MAM均能提供全面的鉴定和位点特异性信息，从而帮助研究人员更好的理解每个位点的变化对于电荷异质性的贡献（图5）。除了能够提供修饰位点的精确信息，MAM还能够提供更加全面的信息。例如，传统氧化分析方法只能提供Fc区一个目标位点的定量结果，而MAM可以同时提供多个位点/多种氧化修饰的定量结果。

图5 使用MAM对电荷变异体进行精确到位点的鉴定与定量。

案例三

使用MAM研究制剂对于非酶解相关的赖氨酸糖化的影响

对于案例二中的强制加热降解样品，研究人员使用MAM评估了含蔗糖制剂和含海藻糖制剂对于赖氨酸糖化的影响。由图6能够看出，MAM可以提供精确至位点的赖氨酸糖化定量信息，可以明显观察到含蔗糖制剂的糖化比率远远高于含海藻糖制剂。与此同时，赖氨酸糖化的热点也得到了鉴定。

图6 使用MAM鉴定不同制剂中非酶解相关的赖氨酸糖化。由图中可知，制剂一导致的赖氨酸糖化风险更高。

小结

● 通过与赛默飞的合作，辉瑞成功地在多个实验室部署了MAM，用于生物ZL产品的发展；

● 使用MAM，可以实现用一种方法同时对多个PQA进行直接分析，在对产品获得更深入理解的同时也大大提高了效率；

● 辉瑞目前正在积极实施MAM开发项目以支持非GMP下的PQA监控，并对实际应用角度的、为研发后期所开发的MAM工作流程进行评估；

● 到目前为止，MAM的数据与一些传统分析手段可以很好地吻合，对于几个发展中的项目，MAM已可以针对特定PQA，实时或通过追溯当前和以前的数据集对比来提供关键信息，以帮助解决与结构/功能相关的关键问题；

● 辉瑞计划在完成方法验证以及必要的合规性和风险评估后的3-5年内，在QC实验室实施MAM。

“One of the most important actions that have come from these meetings is Thermo Fisher Scientific’s readiness to incorporate changes in their software to make the method easier for the end user”

--Jason Rouse

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参考文献：

1. Rogers, R., et al. Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. MAbs, 2015, 7, 881. 

2. Rich Rogers discusses his vision of what the future may hold for the multi-attribute method (MAM) in the biopharmaceutical industry. Case Study 73479.