如何轻松实现高质量的双色、三色、四色完全同步成像？

在上期“单分子成像：实话讲，sCMOS真心倍儿香!”文章的末尾，我们提到了“双色成像”这个话题。关于在显微成像中，什么样的实验需要用到双色成像，这里就不赘述了。而对于这类应用来讲，均需尽可能地将两个不同颜色荧光信号，在同一时刻拍摄下来。这就是我们接下来要说的“双色同步成像”，即完全同时地拍摄两个颜色通道的荧光信号。

实现这样的成像，最直接的思路，是在原本黑白的相机芯片基础上，将每个像素前添加滤光涂层（一般为红、绿、蓝三种）；又或者采用滤光块转盘或采用滤光轮，来进行不同颜色之间的切换。

滤光涂层：会吸收或反射部分入射光信号，影响成像信噪比；其次，由于不同像素前存在不同颜色的滤光涂层，对于单色光信号（如荧光信号）的实际分辨率将被降低。

滤光块转盘或滤光轮：无法做到完全同步拍摄两个颜色的图片，影响实验的时间分辨率，造成数据误差。

而一个名为“W-VIEW GEMINI”的双色分光器，则可以wan美地解决所有问题，实现方便、快捷、高质量的双色，甚至是三色、四色的完全同步成像。下面我们就来看看以它搭配单相机，以及双相机的两套具体解决方案吧！【前方大量实例预警】

单相机方案

一台相机也可以实现双色同步成像

滨松W-VIEW GEMINI双色分光器可将成像信号按照颜色进行分光，配合高速高灵敏度的滨松ORCA-Flash4.0系列sCMOS相机，以及其专门开发的W-VIEW读出模式（可成像于同一台相机芯片两边），构成一套使用极其灵活的双色同步成像解决方案。

我们先来划出这套方案的3个ZD：

· 双色分光器可随意更换滤光片，使用灵活方便；

· ORCA-Flash 4.0系列sCMOS相机具备W-VIEW读出模式，使用灵活方便+1；

· ORCA-Flash 4.0系列sCMOS相机，保证了极高速的成像能力。

随意更换滤光片

W-VIEW GEMINI允许使用者自行更换其中的滤光片以灵活适应于各种颜色/波长之间的分光需求。其中的滤光片尺寸为显微镜中常用的标准尺寸，zui大限度地方便研究者对于滤光片的挑选使用。

关注滨松微信公众号，回复“双色成像0907”可获得W-VIEW GEMINI介绍视频。不仅包含更换滤光片的操作，而且包含分光模式/By-pass模式切换操作以及光路校正操作的介绍演示。

W-VIEW读出模式

ORCA-Flash4.0系列sCMOS相机具备W-VIEW读出模式，W-VIEW GEMINI可以将两种颜色的信号成像到一台相机的一个感光芯片上，可以分别调整同一芯片上下两半的曝光时间。

所以在采用W-VIEW GEMINI配合ORCA-Flash 4.0系列sCMOS相机的时候，就可以非常灵活地调整两个颜色信号的相对亮度，得到更加能够突出所需信号和结构的图片。在两个颜色通道的信号差别非常大的时候，这种灵活的曝光时间设置，就可以针对不同的波长设置不同的曝光时间，同时保证两个波长信号的信噪比。

高速双色同步成像

ORCA-Flash4.0是滨松sCMOS相机的一个经典系列，以高性能圈粉无数。接下来，我们就来看看它与W-VIEW GEMINI的双色同步成像方案的实际案例吧。

作者在300-500帧/秒单层光片(lightsheet)成像的基础上，实现了针对斑马鱼心脏的3D高速光片双色成像。滨松的双色同步成像方案被用于这一套“high-speed SPIM”系统中。

对于高速高灵敏度的Flash 4.0 sCMOS相机，作者也在文章中专门提到："… Ourdata demonstrate that the high acquisition speed of SPIM with modern sCMOScameras (400 fps for 512 × 512 pixels) is key for optimal 3D reconstructions ofthe beating heart."

斑马鱼尾部血管中的部分血细胞被标记了绿色的荧光。为了区分清楚同时处于高速运动状态的被标记细胞和普通细胞，以及看清楚其具体的行为，我们不仅需要高速采像，而且需要完全同步地拍摄到样品荧光和明场的图像；否则对于这样高速运动的样品，先拍一张明场再拍一张荧光就很难做到细胞的一一对应。

为达到这些要求，实验采用红光进行明场的拍摄，这样W-VIEW GEMINI双色分光器就可以将红色的明场信号及绿色的荧光信号分光并成像到相机芯片的两边（参见下右的光路示意图），实现完全同步地荧光和明场成像。

双相机方案

多色同步成像

滨松W-VIEW GEMINI-2C同样是一个双色分光器，能够将成像信号按照颜色进行分光并成像于两台相机上。2C的设计初衷，是为了方便需要双色同步的尖 端成像应用的开发与研究。所以在超分辨级别光学质量的基础上，2C还具有较好的灵活性。

同样，我们来划3个ZD：

· 可随意更换滤光片；

· 可针对光瞳面（Pupil Plane）进行各种操作与观察；

· 可扩展为3色、4色的同步成像。

随意更换滤光片

 W-VIEW GEMINI-2C允许使用者自行更换其中的滤光片以灵活适应于各种颜色/波长之间的分光需求。其中的滤光片尺寸为显微镜中常用的标准尺寸，且在滤光片厚度上有着更大的灵活性，zui大限度地方便研究者对于滤光片的挑选使用。

针对光瞳面（Pupil Plane）的操作

W-VIEW GEMINI-2C采用了模块化的设计，在基础配置之外，也为使用者提供了各种附件选项以满足各类需求。其中对于光瞳面（Pupil Plane）的操作需求我们可以提供3类附件:

（1）三轴支架附件（triaxialholder，A12802-12）：此附件辅助使用者将所需的光学元件（直径25.4mm，厚度不超过5mm）安装在光路中的光瞳面上并允许进行位置调整，其中xy轴的调整范围为1mm，z轴为2.5mm。

（2）勃氏镜附件（BertrandLens Unit，A12802-13）：安装之后允许对光瞳面/后焦面进行成像，方便光路的校正与调整。

（3）透镜附件（Field LensUnit，A12802-20，21）：此附件为透镜支架，主要用于调整光瞳面的位置，使用者可以根据前端光路（如显微镜光路）的特征自行选择合适的透镜进行安装。

如上所述，三轴支架附件（A12802-12）可以帮助将任意光学元件放置于光瞳面，为W- VIEW GEMINI-2C的应用提供了许多的可扩展空间。例如我们可以在光瞳面中引入phase mask（由Double Helix提供）以调整光路的点扩散函数（PSF），从而得到将z轴的信息，方便3D双色的高速成像。

多色同步成像的扩展

W-VIEW GEMINI-2C可以将成像信号按照颜色分为两路。如果将两台联用，或与两个W-VIEW GEMINI联用，则可以分别达到3相机3色同步成像、或双相机4色同步成像的要求。

方便光路矫正

在灵活的同时，W- VIEW GEMINI-2C的设计也着重考虑了光路校正的便利。为了让两个通道图像的重合度达到设计值（不重合度低于一个像素），在W-VIEW GEMINI-2C上不仅提供了轴向色差校正旋钮、相机接口旋转校正旋钮以及xy平移校正反射镜，而且提供焦距校正附件（ZOOM Correction Lens Unit，A12802-11）以及可以放置于成像共轭面中的网格附件（Grid Chart Unit，A12802-14）以方便精细的校正。