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Milo助力急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)新型机制研究结果发Nature!!

ProteinSimple, a biotechne brand 2020-09-07 11:23:11 447  浏览
  • 近日,由希望之城综合癌症ZX系统生物学系、波士顿达纳法伯癌症研究所、哈佛医学院、加州大学旧金山分校检验医学系、剑桥大学血液学系、匹兹堡大学药物发现研究所及东芬兰大学分子科学研究所等多ZX研究所,利用Milo,探讨ZL急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的新型抑癌机制,并在Nature(IF:42.778)上发表:Signalling input from divergent pathways subverts B cell transformation, Nature. 2020 Jul;583(7818):845-851.

    --研究内容--

    细胞的恶性转化通常涉及一些基因的病变,其综合活性会导致癌症。本研究分析了1,148例患者来源的急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的样本,发现单个基因的突变不会促进白血病的发生,除非它们在表征B细胞分化阶段的单一致癌途径。与主要致癌驱动因子不一致的突变则会激活不同的信号通路,从而直接破坏B细胞的转化。B-ALL中的致癌病变通常模仿前B细胞阶段的细胞因子受体(通过激活信号转导蛋白STAT5)或更成熟细胞中的前B细胞受体中(通过激活蛋白激酶ERK)的信号传导。STAT5和ERK激活性病变很常见,但二者仅在约3%的病例中同时发生。单细胞突变和磷酸化蛋白分析显示致癌的STAT5和ERK激活与竞争性克隆分离。STAT5和ERK参与相反的生化和转录过程,且分别由转录因子MYC和BCL6调控。当不同的信号通路被重激活时,主要致癌驱动因子受到YZ,从而逆转了B细胞转化。相反,不同途径组分的缺失会加速白细胞生成。因此,不同信号通路的持久性成为了B细胞转化的强大障碍,而在一个主要驱动因素上的趋同则促使了白血病发作。不同信号通路的药理学重激活,可以与YZ主要致癌驱动因子产生协同作用。因此,差异信号通路的重新激活可以作为先前未被认可的策略来增强B-ALLZL反应。

    --Milo实验方法--

    实验目的:

    为了测试在同一细胞中是否同时发生STAT5和ERK双通路激活的罕见情况

    实验条件:

    细胞密度: 25万个细胞/ml

    试剂盒: K500

    多细胞落空率<2%

    沉降时间: 7-10 min

    裂解时间: 10s

    电泳分离时间: 60s

    检测靶点: STAT5 phosphorylation (Y694) and ERK phosphorylation (T202/Y204),同一荧光通道,不同分子量大小进行区分

    一抗孵育条件:1:15, 4度过夜

    二抗孵育条件: 1:20,室温1hr

    定义“阳性孔”的方法: 内参Histone H3和TOTO DNA staining

    --实验结论--

    Milo检测结果发现,STAT5和ERK双通路激活的概率为2%,与双细胞落空率相当,故在同一个细胞中发生双通路激活几乎不可能,STAT5和ERK激活信号通路互不兼容。

    结论:

    未转化的B细胞不断与周围的环境交换信息,这取决于参与几种不同的信号途径(例如细胞因子受体和BCR途径)。因此,多种多样的信号输入反映了正常细胞与其环境的相互作用,而在一个ZX途径上的融合则是B细胞转化的标志。与主要致癌驱动因子不一致的趋异途径的失活是B细胞转化过程中的关键步骤。分歧和潜在冲突的信号通路的重新激活是B细胞恶性转化的强大障碍。因此,从ZL的角度来看,有针对性的重新激活发散途径以干扰主要的致癌驱动因子可能是扩大ZL反应的一种有前途的策略。



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Milo助力急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)新型机制研究结果发Nature!!

近日,由希望之城综合癌症ZX系统生物学系、波士顿达纳法伯癌症研究所、哈佛医学院、加州大学旧金山分校检验医学系、剑桥大学血液学系、匹兹堡大学药物发现研究所及东芬兰大学分子科学研究所等多ZX研究所,利用Milo,探讨ZL急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的新型抑癌机制,并在Nature(IF:42.778)上发表:Signalling input from divergent pathways subverts B cell transformation, Nature. 2020 Jul;583(7818):845-851.

--研究内容--

细胞的恶性转化通常涉及一些基因的病变,其综合活性会导致癌症。本研究分析了1,148例患者来源的急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的样本,发现单个基因的突变不会促进白血病的发生,除非它们在表征B细胞分化阶段的单一致癌途径。与主要致癌驱动因子不一致的突变则会激活不同的信号通路,从而直接破坏B细胞的转化。B-ALL中的致癌病变通常模仿前B细胞阶段的细胞因子受体(通过激活信号转导蛋白STAT5)或更成熟细胞中的前B细胞受体中(通过激活蛋白激酶ERK)的信号传导。STAT5和ERK激活性病变很常见,但二者仅在约3%的病例中同时发生。单细胞突变和磷酸化蛋白分析显示致癌的STAT5和ERK激活与竞争性克隆分离。STAT5和ERK参与相反的生化和转录过程,且分别由转录因子MYC和BCL6调控。当不同的信号通路被重激活时,主要致癌驱动因子受到YZ,从而逆转了B细胞转化。相反,不同途径组分的缺失会加速白细胞生成。因此,不同信号通路的持久性成为了B细胞转化的强大障碍,而在一个主要驱动因素上的趋同则促使了白血病发作。不同信号通路的药理学重激活,可以与YZ主要致癌驱动因子产生协同作用。因此,差异信号通路的重新激活可以作为先前未被认可的策略来增强B-ALLZL反应。

--Milo实验方法--

实验目的:

为了测试在同一细胞中是否同时发生STAT5和ERK双通路激活的罕见情况

实验条件:

细胞密度: 25万个细胞/ml

试剂盒: K500

多细胞落空率<2%

沉降时间: 7-10 min

裂解时间: 10s

电泳分离时间: 60s

检测靶点: STAT5 phosphorylation (Y694) and ERK phosphorylation (T202/Y204),同一荧光通道,不同分子量大小进行区分

一抗孵育条件:1:15, 4度过夜

二抗孵育条件: 1:20,室温1hr

定义“阳性孔”的方法: 内参Histone H3和TOTO DNA staining

--实验结论--

Milo检测结果发现,STAT5和ERK双通路激活的概率为2%,与双细胞落空率相当,故在同一个细胞中发生双通路激活几乎不可能,STAT5和ERK激活信号通路互不兼容。

结论:

未转化的B细胞不断与周围的环境交换信息,这取决于参与几种不同的信号途径(例如细胞因子受体和BCR途径)。因此,多种多样的信号输入反映了正常细胞与其环境的相互作用,而在一个ZX途径上的融合则是B细胞转化的标志。与主要致癌驱动因子不一致的趋异途径的失活是B细胞转化过程中的关键步骤。分歧和潜在冲突的信号通路的重新激活是B细胞恶性转化的强大障碍。因此,从ZL的角度来看,有针对性的重新激活发散途径以干扰主要的致癌驱动因子可能是扩大ZL反应的一种有前途的策略。



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Jess老年痴呆研究结果发表在Nature主刊

       文章:NLRP3 inflammasome activation drives tau pathology

       期刊:Nature volume 575, pages,669–673(2019)

       主要作者单位:

       1.Department of Neurodegenerative Diseases and Geriatric Psychiatry, University Hospital of Bonn, Bonn, Germany.

       2.German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), Bonn, Germany.


        研究摘要

        阿尔茨海默病是Z主要的老年痴呆疾病,其特点是斑块状淀粉样蛋白-β的积累,神经原纤维缠结中过度磷酸化的Tau的聚集,以及神经炎症,共同导致神经变性和认知功能下降。NLRP3炎症小体在激活小胶质细胞内聚集,导致caspase-1和下游白细胞介素-1β,切割,释放和活性成熟。NLRP3炎症小体已被证明是必不可少的。

       淀粉样蛋白-β在小鼠模型疾病的发展和进展尚不清楚。在此,作者发现NLRP3炎性小体功能的丧失,通过调节tau磷酸酶和激酶,降低tau磷酸化和和聚集。Tau激活NLRP3炎性小体,脑内注射含纤维淀粉样蛋白的脑匀浆,以NLRP3依赖的方式诱导tau病理。这些数据确定了小胶质细胞和NLRP3炎性小体激活在阿尔茨海默病发病机制中的重要作用,并支持阿尔茨海默病的淀粉样细胞学假说,表明神经原纤维缠结发展为淀粉样β诱导的小胶质细胞激活的下游途径。

炎性小体在神经退行性疾病中作用示意图

炎性小体活化及信号通路示意图

       Jess检测条件培养基中分泌性Caspase-1

       实验方法

       For caspase-1 detection or collection of conditioned medium for neuronal experiments, 2 million microglia or 600,000 microglia per well were plated in a 6-well plate.caspase-1secretion by using a Jess system (ProteinSimple). Here, samples were run undiluted on a 12–230-kDa separation module according to the manufacturer’s instructions and detection was achieved by using a caspase-1 antibody (Adipogen) at 1:50. Data were analysed with Compass software version 4.0.0 (ProteinSimple).

       结果

        结果说明原文:Jess-based analysis of conditioned medium of LPS + tau wild-type-treated wild-type microglia stained for caspase-1. LPS/ATP-treated wild-type microglia served as positive control

       结果说明原文:Jess-based analysis of conditioned medium of primary wildtype,Asc–/– and Nlrp3–/– microglia primed with LPS and treated with the indicated forms of tau P301S. LPS/ATP-treated wild-type microglia served as positive control. Samples were stained for caspase-1.



(来源:ProteinSimple)


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--研究背景--


杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD):是一种X染色体隐性遗传疾病,主要发生于男孩。据统计,平均每3500个新生男 婴中就有一人罹患此病。患者一般在3-5岁开始发病,Z早表现出进行性腿部肌无力(爬楼梯困难),导致不便行走。12岁时失去行走能力,常年与轮椅为伴,20岁-30岁因呼吸衰竭而死亡。


抗肌萎缩蛋白(Dystrophin):由X染色体短臂Xp21基因编码,分布于骨骼肌和心肌细胞膜的质膜面,起细胞支架作用,维持肌纤维完整性和抗牵拉功能。由于基因变异引起的Dystrophin缺乏是进行性肌营养不良的主要病因。

--研究内容--


编码抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)的基因产生移码突变会导致杜氏肌营养不良(DMD),从而导致患者出现终末肌肉和心力衰竭。通过序列特异性核酸酶进行的体细胞基因编辑为恢复DMD阅读框提供了新的选择,表达缩短的但功能强的抗肌萎缩蛋白。本文在缺少DMD外显子52(DMDΔ52)的DMD猪模型以及相应的患者诱发的多能干细胞模型中验证了这种方法。在DMDΔ52猪中,肌内注射腺相关病毒载体(AAV9),该载体携带intein-split Cas9和一对靶向于外显子51(AAV9-Cas9-gE51)的导向RNA,诱导了缩短的抗肌萎缩蛋白(DMDΔ51-52)的表达,以及改善骨骼肌功能。此外,AAV9-Cas9-gE51的全身应用使抗肌萎缩蛋白(DMDΔ51–52)在肌肉(包括隔膜和心脏)中广泛表达,延长了存活时间并减少了心律失常的易感性。类似地,在缺乏DMDΔ52的患者的诱导性多能干细胞来源的成肌细胞和心肌细胞中,AAV6-Cas9-g51介导的外显子51的切除可恢复抗肌萎缩蛋白的表达并减轻骨骼肌肌管的形成,以及异常的心肌Ca2+处理和心律失常的易感性。在这些转化模型中,Cas9介导的外显子切除改善了DMD病理学的能力,为DMD患者的ZL方法提供了新方向。


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文献速递ㅣ动物活体成像系统在白血病耐药机制研究中的应用

慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一种由造血干细胞染色体t(9;22)(q34;q11)易位引起,并在分子水平上形成Bcr-Abl融合基因的骨 髓增生性疾病。使用酪氨酸激酶抑 制剂(Tyrosine kinase inhibitors, TKIs)可以缓解疾病,但TKIs耐药性是治 疗失败或诱发急性白血病的主要问题。


根据Abl激酶结构域点突变的不同,TKIs的耐药机制主要包括Bcr-Abl依赖型和非Bcr-Abl依赖型。Bcr-Abl依赖型的耐药性最常见,它会干扰小分子酪氨酸激酶抑 制剂伊马替尼(Imtatinib, IM)结合和随后的激酶抑 制。然而,超过50%的耐药CML患者中并没有Bcr-Abl突变。


▲ 慢性髓系白血病


蛋白激酶C(Protein kinases C, PKCs)在细胞周期调节、增殖、凋亡和造血干细胞分化等多种细胞过程中发挥作用,并和Bcr-Abl协调参与对恶性细胞转化至关重要的几种信号通路。实验和临床证据表明,使用PKC抑 制剂可以有效地治 疗CML。最近,不同的PKC亚型也被报道参与CML细胞的耐药,但是,PKC信号在CML TKIs耐药中的作用并不清楚。


▲ 蛋白激酶C的晶体结构


近日,贵州医科大学王季石教授课题组根据先前的研究结果:一种泛PKCs抑 制剂星孢菌素(Stauroporine)在低浓度下可以有效地逆转K562R细胞(没有任何突变)的IM耐药,因此推测Bcr-Abl非依赖型IM耐药可能是由PKC亚型介导。在此基础上,鉴于白血病干细胞(Leukemia stem cells)在CML TKIs耐药中起基础性作用,研究首次在Bcr-Abl非依赖型TKI耐药的CML患者CD34+细胞中检测到9种PKCs亚型的表达。对PKC亚型异常表达所介导的机制进行深入研究时,使用博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统拍摄的活体成像实验结果,从体内进一步证明PKC-β的过表达与肿瘤耐药密切相关,表明靶向PKC-β过表达可能是克服CML耐药的一种新的治 疗机制。


相关成果已发表在期刊《Journal of Cellular Physiology》。


▲抑 制PKC-β可增强IM对CML细胞的体内杀伤作用

(a) 博鹭腾AniView100拍摄的不同药物处理的CML小鼠模型中白血病细胞的活体示踪成像图。LY333531: PKCβ 抑 制剂。

(b) 流式细胞仪检测各组小鼠CD33+和CD45+细胞。

(c) 直方图显示流式细胞仪检测的各组小鼠CML细胞的差异。

(d) 各组小鼠的生存曲线。

(e、f) 比较各组小鼠脾 脏体积和重量。

(g、h) Wright‘s染色检测各组小鼠外周血中CML的进展情况。统计学处理采用t检验。**表示p<0.01,*表示p<0.05。



参考文献

1、Ma D, et al. PKC‐β/Alox5 axis activation promotes Bcr‐Abl‐independent TKI‐resistance in chronic myeloid leukemia[J]. Journal of Cellular Physiology, 2021.

2、Zubair M S, et al. Cembranoid Diterpenes as Antitumor: Molecular Docking Study to Several Protein Receptor Targets[C]// International Conference on Computation for Science & Technology. 2015.


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