深蓝云qPCR知识小课堂---TaqMan探针法

在之前发表的文章《实时荧光定量PCR检测方法，你选对了吗?》中提到，实时荧光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探针法、分子信标、荧光共振能量传递(FRET)和LUX Primers等。那么应用最为广泛的则是SYBR Green染料法和TaqMan探针法，两者各有所长。今天，先给大家介绍TaqMan探针法，它优秀在哪里？

TaqMan 探针法

最关键的Taqman探针，是一条与靶序列特异性结合的寡核苷酸序列，其能够结合到正反向引物结合区域的中间部位，随着PCR反应的进行，DNA聚合酶在延伸到探针位置时会将其水解，从而释放荧光基团，扩增产物产生信号。

TaqMan探针法的优势

☑  高特异性，只有在探针和靶标基因之间发生特异性的水解，才会生成荧光信号。

☑  多重分析，可选择不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测多个不同的序列。

☑  无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

探针序列的设计原则

1. TaqMan探针的长度zuihao不超过30bp。理想情况下，有15bp可获得ZJ特异性；

2. Tm值在67℃-72℃之间，确保探针的Tm值比引物的高5-10℃，在退火过程中优先结合到模板上；

3. 探针序列的GC含量在20％至80％之间，避免多个重复的碱基出现，尤其要避免4个或超过4个的G碱基；

4. 探针尽量避免出现二聚体或者发夹结构，以保证足够高的模板结合效率；

5. 探针5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

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如何选择荧光基团和淬灭基团

修饰基团的选择是探针法的重要环节，那么我们需要注意以下几项：

1. 根据荧光定量PCR仪荧光通道，选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA，自身会发出荧光信号，干扰检测结果，后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 进行多重qPCR检测时，每个通道要选择不同的荧光基团，且避免各标记基团的激发和发射波长重叠，出现荧光干扰的情况。

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