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有望1分钟内完成肿瘤活检 | 《NATURE》子刊发表活体荧光内窥式激光共聚焦成像技术在诊断口/咽/食道癌上的新技术

广州云星科学仪器有限公司 2020-04-09 14:13:23 348  浏览
  •        一些暴露在体表外的上皮组织肿瘤导致的癌症,如口腔癌、口咽癌和食道癌,相较于其他组织癌症更容易通过观察和鉴别粘膜表面的可见变化进行筛查。但是根据美国国家癌症研究所的数据显示,只有29%的口腔癌和口咽癌和19%的食道癌是在癌症早期发现的。对于非转移性肿瘤,5年生存率分别为83.7%(口腔癌和口咽癌)和45.2%(食管癌);而转移性肿瘤的5年生存率则分别只有39.1%和4.8%。手术边缘残留肿瘤的存在也会产生负面影响,这说明:目前临床的肉眼判断结合活检为基础的组织病理学诊断还不能够达到良好的早期诊断目的。

           早期发现肿瘤和术后检查残余肿瘤的准确性是直接关系到癌症复发率和患者生存率的预后因素。美国纪念斯隆-凯特琳癌症ZX的Thomas Reiner团队利用DNA修复酶PARP1作为癌症细胞的靶向高对比度标记物,结合OptiScan公司的ViewnVivo活体荧光内窥式激光共聚焦成像技术,发明了一种快速、灵敏的活检手段,应用于早期上消化道上皮性肿瘤的手术边缘评估。该项研究于2020年3月发表在《nature》子刊《biomedical engineering》上。

    图1. PARPi-FL应用于新鲜组织的共聚焦显微成像具有与组织切片同样的清晰度

            PARPYZ剂奥拉帕尼是获得FDA批准的药物,PARPi-FL是该类YZ剂的荧光标记类似物,因其对PARP1具有高度的亲和力和特异性,可作为PARP1的靶向显像剂。PARPi-FL是一种细胞穿透成像剂,在没有与机体内细胞进行靶向结合的情况下可被快速代谢清除。与其他核染色活性染料相比,PARPi-FL不插入DNA,而是可逆地与PARP1结合,PARP1作用于DNA链断裂,不具有致突变性。前人利用静脉注射PARPi-FL后证明其可作用于全身和细胞水平上高对比度异种移植成像。并且,PARPi-FL的组织穿透性使其能够替代静脉注射作为局部药物使用,应用小剂量的PARPi FL即可立即成像。

    图2. PARP1作为肿瘤标志物具有很强的特异性和标志物信号强度

           与组织深层深层和上皮相比,肿瘤内PARP1阳性区域明显高于上皮(5.0%±1.9%,P = 0.03)和组织深层(0.9%±0.5%,P = 0.02)(图2b)。利用viewnvivo从组织表面垂直断层扫描的结果表面,深层的影像也可十分清晰捕捉(图2c)

           Thomas团队在对PARP1在食管癌中的表达研究中发现,包括腺癌和鳞状细胞癌(T1-T3期)在内的一些肿瘤组织,PARP1表达水平均高于正常上皮和粘膜下深层组织,表明正常组织和肿瘤组织之间存在明显的定量差异。PARP1表达增加导致PARPi-FL摄取增加,这个增加的比例在肿瘤中高于正常组织20倍。研究人员对比了多个动物模型,发现PARP1表达比例Z低的是小鼠模型,但即使这样,小鼠模型中PARP1在肿瘤中的PARPi-FL信号也比在正常食管中高出了6倍。这些数据表明,用上述方式在食管中进行高对比度无创内镜成像是可行的。

    图3. PARPi-FL共聚焦影像活检在临床上的应用

           为了进行PARPi-FL的人体成像,让经组织病理学确诊的口腔鳞状细胞癌患者用含PARPi-FL的溶液漱口后,使用多光子成像技术拍摄荧光图像。良性肉芽肿(蓝圈)和肿瘤(黄圈)区域都有PARPi-FL积累,但是特异性的PARPi-FL仅在肿瘤中可检测到。表明了相较于良心增生组织,肿瘤对于PARPi-FL具有很强的特异性,可以应用于影像学提高癌症检出率。虽然使用PARPi-FL作为荧光造影剂还在临床试验中,但上述实验可以证明使用漱口水的方法进行局部肿瘤活体评估已成为可能。

    图4. ViewnVivo活体荧光内窥式激光共聚焦成像系统

           Z后,搭配ViewnVivo活体成像技术的PARPi-FL激光成像结果与免疫组化PARP1组织切片染色结果非常相似,活体成像Z快 1分钟即可完成。一旦外科医SF现阳性边缘,可以立即进行再次切除和边缘评估。在PARPi-FL共聚焦荧光成像后可保持新鲜组织完整,该组织可用于后续其他研究,如组织病理学、蛋白质组学或基因组分析。

    图5. 操作简便的ViewnVivo成像效果与光学显微镜下免疫组化染色结果相媲美

           相信不久以后,活体荧光内窥式激光共聚焦成像技术诊断恶性肿瘤方法会普及应用到早期鳞状上皮癌症的诊断,帮助外科医生对手术进行评估,提高检出率,减少患着痛苦。


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有望1分钟内完成肿瘤活检 | 《NATURE》子刊发表活体荧光内窥式激光共聚焦成像技术在诊断口/咽/食道癌上的新技术

       一些暴露在体表外的上皮组织肿瘤导致的癌症,如口腔癌、口咽癌和食道癌,相较于其他组织癌症更容易通过观察和鉴别粘膜表面的可见变化进行筛查。但是根据美国国家癌症研究所的数据显示,只有29%的口腔癌和口咽癌和19%的食道癌是在癌症早期发现的。对于非转移性肿瘤,5年生存率分别为83.7%(口腔癌和口咽癌)和45.2%(食管癌);而转移性肿瘤的5年生存率则分别只有39.1%和4.8%。手术边缘残留肿瘤的存在也会产生负面影响,这说明:目前临床的肉眼判断结合活检为基础的组织病理学诊断还不能够达到良好的早期诊断目的。

       早期发现肿瘤和术后检查残余肿瘤的准确性是直接关系到癌症复发率和患者生存率的预后因素。美国纪念斯隆-凯特琳癌症ZX的Thomas Reiner团队利用DNA修复酶PARP1作为癌症细胞的靶向高对比度标记物,结合OptiScan公司的ViewnVivo活体荧光内窥式激光共聚焦成像技术,发明了一种快速、灵敏的活检手段,应用于早期上消化道上皮性肿瘤的手术边缘评估。该项研究于2020年3月发表在《nature》子刊《biomedical engineering》上。

图1. PARPi-FL应用于新鲜组织的共聚焦显微成像具有与组织切片同样的清晰度

        PARPYZ剂奥拉帕尼是获得FDA批准的药物,PARPi-FL是该类YZ剂的荧光标记类似物,因其对PARP1具有高度的亲和力和特异性,可作为PARP1的靶向显像剂。PARPi-FL是一种细胞穿透成像剂,在没有与机体内细胞进行靶向结合的情况下可被快速代谢清除。与其他核染色活性染料相比,PARPi-FL不插入DNA,而是可逆地与PARP1结合,PARP1作用于DNA链断裂,不具有致突变性。前人利用静脉注射PARPi-FL后证明其可作用于全身和细胞水平上高对比度异种移植成像。并且,PARPi-FL的组织穿透性使其能够替代静脉注射作为局部药物使用,应用小剂量的PARPi FL即可立即成像。

图2. PARP1作为肿瘤标志物具有很强的特异性和标志物信号强度

       与组织深层深层和上皮相比,肿瘤内PARP1阳性区域明显高于上皮(5.0%±1.9%,P = 0.03)和组织深层(0.9%±0.5%,P = 0.02)(图2b)。利用viewnvivo从组织表面垂直断层扫描的结果表面,深层的影像也可十分清晰捕捉(图2c)

       Thomas团队在对PARP1在食管癌中的表达研究中发现,包括腺癌和鳞状细胞癌(T1-T3期)在内的一些肿瘤组织,PARP1表达水平均高于正常上皮和粘膜下深层组织,表明正常组织和肿瘤组织之间存在明显的定量差异。PARP1表达增加导致PARPi-FL摄取增加,这个增加的比例在肿瘤中高于正常组织20倍。研究人员对比了多个动物模型,发现PARP1表达比例Z低的是小鼠模型,但即使这样,小鼠模型中PARP1在肿瘤中的PARPi-FL信号也比在正常食管中高出了6倍。这些数据表明,用上述方式在食管中进行高对比度无创内镜成像是可行的。

图3. PARPi-FL共聚焦影像活检在临床上的应用

       为了进行PARPi-FL的人体成像,让经组织病理学确诊的口腔鳞状细胞癌患者用含PARPi-FL的溶液漱口后,使用多光子成像技术拍摄荧光图像。良性肉芽肿(蓝圈)和肿瘤(黄圈)区域都有PARPi-FL积累,但是特异性的PARPi-FL仅在肿瘤中可检测到。表明了相较于良心增生组织,肿瘤对于PARPi-FL具有很强的特异性,可以应用于影像学提高癌症检出率。虽然使用PARPi-FL作为荧光造影剂还在临床试验中,但上述实验可以证明使用漱口水的方法进行局部肿瘤活体评估已成为可能。

图4. ViewnVivo活体荧光内窥式激光共聚焦成像系统

       Z后,搭配ViewnVivo活体成像技术的PARPi-FL激光成像结果与免疫组化PARP1组织切片染色结果非常相似,活体成像Z快 1分钟即可完成。一旦外科医SF现阳性边缘,可以立即进行再次切除和边缘评估。在PARPi-FL共聚焦荧光成像后可保持新鲜组织完整,该组织可用于后续其他研究,如组织病理学、蛋白质组学或基因组分析。

图5. 操作简便的ViewnVivo成像效果与光学显微镜下免疫组化染色结果相媲美

       相信不久以后,活体荧光内窥式激光共聚焦成像技术诊断恶性肿瘤方法会普及应用到早期鳞状上皮癌症的诊断,帮助外科医生对手术进行评估,提高检出率,减少患着痛苦。


2020-04-09 14:13:23 348 0
如何能够发表到Nature及其子刊
 
2018-11-26 23:19:08 492 0
Jess老年痴呆研究结果发表在Nature主刊

       文章:NLRP3 inflammasome activation drives tau pathology

       期刊:Nature volume 575, pages,669–673(2019)

       主要作者单位:

       1.Department of Neurodegenerative Diseases and Geriatric Psychiatry, University Hospital of Bonn, Bonn, Germany.

       2.German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), Bonn, Germany.


        研究摘要

        阿尔茨海默病是Z主要的老年痴呆疾病,其特点是斑块状淀粉样蛋白-β的积累,神经原纤维缠结中过度磷酸化的Tau的聚集,以及神经炎症,共同导致神经变性和认知功能下降。NLRP3炎症小体在激活小胶质细胞内聚集,导致caspase-1和下游白细胞介素-1β,切割,释放和活性成熟。NLRP3炎症小体已被证明是必不可少的。

       淀粉样蛋白-β在小鼠模型疾病的发展和进展尚不清楚。在此,作者发现NLRP3炎性小体功能的丧失,通过调节tau磷酸酶和激酶,降低tau磷酸化和和聚集。Tau激活NLRP3炎性小体,脑内注射含纤维淀粉样蛋白的脑匀浆,以NLRP3依赖的方式诱导tau病理。这些数据确定了小胶质细胞和NLRP3炎性小体激活在阿尔茨海默病发病机制中的重要作用,并支持阿尔茨海默病的淀粉样细胞学假说,表明神经原纤维缠结发展为淀粉样β诱导的小胶质细胞激活的下游途径。

炎性小体在神经退行性疾病中作用示意图

炎性小体活化及信号通路示意图

       Jess检测条件培养基中分泌性Caspase-1

       实验方法

       For caspase-1 detection or collection of conditioned medium for neuronal experiments, 2 million microglia or 600,000 microglia per well were plated in a 6-well plate.caspase-1secretion by using a Jess system (ProteinSimple). Here, samples were run undiluted on a 12–230-kDa separation module according to the manufacturer’s instructions and detection was achieved by using a caspase-1 antibody (Adipogen) at 1:50. Data were analysed with Compass software version 4.0.0 (ProteinSimple).

       结果

        结果说明原文:Jess-based analysis of conditioned medium of LPS + tau wild-type-treated wild-type microglia stained for caspase-1. LPS/ATP-treated wild-type microglia served as positive control

       结果说明原文:Jess-based analysis of conditioned medium of primary wildtype,Asc–/– and Nlrp3–/– microglia primed with LPS and treated with the indicated forms of tau P301S. LPS/ATP-treated wild-type microglia served as positive control. Samples were stained for caspase-1.



(来源:ProteinSimple)


2020-01-15 13:14:07 490 0
激光共聚焦荧光显微镜 活体荧光物质检查

激光共聚焦显微镜,简称CLSM(Confocal Laser Scanning Microscopy),是一种利用激光共振效应进行成像的显微镜。它通过使用激光束扫描样品的不同层面,将所得到的图像合成成一幅清晰的三维图像。与传统显微镜相比,激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率和更强的穿透能力,可以观察到更加细微的结构和更深层次的物质。

在活体荧光物质的检查中,激光共聚焦显微镜发挥了重要的作用。通过标记活体细胞或组织的特定结构或分子,激光共聚焦显微镜可以实时观察到这些结构或分子的活动和分布情况。

在生物医学领域,它可以用于观察细胞的生长、分裂和死亡过程,研究细胞信号传导和分子交互作用等。在药物研发中,它可以用于观察药物在活体细胞或组织中的分布情况,评估药物的疗效和毒性。此外,在神经科学领域,激光共聚焦显微镜可以用于观察神经元的活动和连接,揭示大脑的工作机制。

 

NCF950激光共聚焦显微镜较宽场荧光显微镜的优点:

l 能够通过荧光标本连续生产薄(0.5至1.5微米)的光学切片,厚度范围可达50微米或更大。(主要优点)

l 控制景深的能力。

l能够从样品中分离和收集焦平面,从而消除荧光样品通常看到的焦外“雾霾",非共焦荧光显微镜下无法检测到。(最重要的特点)

l  从厚试样收集连续光学切片的能力。

l 通过三维物体收集一系列图像,用于二维或三维重建。

l收集双重和三重标签,精确的共定位。

l 用于对在不透明的图案化基底上生长的荧光标记细胞之间的相互作用进行成像。

l  有能力补偿自发荧光。

 

耐可视共聚焦成像效果图                                                          尼康共聚焦成成像效果图

NCF950激光共聚焦显微镜应用,共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛:

1、细胞生物学:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡;

2、生物化学:酶、核酸、FISH、受体分析

3、药理学:药物对细胞的作用及其动力学;

4、生理学:膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态;

5、遗传学和组胚学:细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断;

6、神经生物学:神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递;

7、微生物学和寄生虫学:细菌、寄生虫形态结构;

8、病理学及病理学临床应用:活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断;

9、生物学、免疫学、环境医学和营养学。

NCF950激光共聚焦显微镜配置

NCF950激光共聚焦配置表

激光器

激光405 nm、488 nm、561 nm、640 nm

探测器

波长:400-750nm,探测器:3个独立的荧光检测通道;1个DIC透射光检测通道

扫描头

最大像素大小:4096 x 4096 扫描速度:2 fps(512 x 512像素,双向),18 fps(512 x 32像素,双向),图像旋转: 360°

扫描模式

X-T, Y-T, X-Y, X-Y-Z, X-Y-Z-T

针孔

无级变速六边形电动针孔;调节范围:0-1.5毫米

共焦视场

φ18mm内接正方形

图像位深

12bits

配套显微镜

NIB950全电动倒置显微镜

光学系统

NIS60无限远光学系统(F200)

目镜(视野)

10×(25),EP17.5mm,视度可调-5~+5,接口Φ30

观察镜筒

铰链式三目观察镜筒,45度倾斜,瞳距47-78mm,目镜接口Φ30,固定视度;1)目/摄切换:(100/0,50/50,0/100);2)目视/关闭目视/可调焦勃氏镜

NIS60物镜

10×复消色差物镜,NA=0.45 WD=4.0 盖玻片=0.17

20×复消色差物镜,NA=0.75 WD=1.1 盖玻片=0.17

60×半复消色差物镜,NA=1.40 WD=0.14 盖玻片=0.17 油镜

100×复消色差物镜,NA=1.45 WD=0.13 盖玻片=0.17 油镜

物镜转换器

电动六孔转换器(扩展插槽),M25×0.75

聚光镜

6孔位电动控制:NA0.55,WD26;相衬(10/20,40,60选配)

DIC(10X,20X/40X)选配.空孔

照明系统

透射柯拉照明,10W LED照明;

落射照明:宽场光纤照明
6孔位电动荧光转盘(B,G,U标配);电动荧光光闸;

中间倍率切换

手动1X,1.5X、共焦切换

机身端口

分光比:

左侧:目视=100:0;右侧:目视=100:0;

平台

电动控制:行程范围130 mm x100 mm (台面325 mm x 144 mm )最大速度:25mm/s;分辨率:0.1μm - 重复精度:3μm。机械可调样品夹板

调焦系统

同轴粗微动升降机构,行程:焦点上7下2;粗调2mm/圈,微调0.002mm/圈;可手动和电动控制,电动控制时,最小步进0.01um;

DIC插板

10X,20X,40X插板;可放置于转换器插槽;选配

控制

摇杆,控制盒,USB连接线

软件

软件:NOMIS Advanced C
图像显示/图像处理/分析
2D/3D/4D图像分析,经时变化分析,三维图像获得及正交显示,图像拼接,多通道彩色共聚焦图像

2023-08-21 11:50:20 98 0
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激光共聚焦扫描显微镜在在焦平面(X-Y)聚焦时是一个点,可是它是移动什么使它能够进行线扫描的呢(即按照一条一条的线扫描,然后得到样品整个表面的结构信息)?还有进行三维重建时,Z轴的移动是通过什么完成的呢?有些资料里面显示聚光镜是装在音叉上面的,这... 激光共聚焦扫描显微镜在在焦平面(X-Y)聚焦时是一个点,可是它是移动什么使它能够进行线扫描的呢(即按照一条一条的线扫描,然后得到样品整个表面的结构信息)?还有进行三维重建时,Z轴的移动是通过什么完成的呢?有些资料里面显示聚光镜是装在音叉上面的,这里的音叉起到的作用又是什么?求解释,谢谢! 展开
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