Maurice iCIEF法用于疫苗质量控制

疫苗根据工艺分为减毒疫苗，灭活疫苗，亚单位疫苗，基因工程疫苗，涉及一系方法进行质量控制，其中等电点及电荷变异体对于鉴别和工艺稳定性至关重要。本文涉及病毒，重组疫苗，mRNA疫苗，病毒样颗粒（VLP)等不同类别疫苗的等电点及电荷异质性检测。

1.新型人乳头瘤病毒（HPV）ZL性疫苗等电点测定

上海泽润生物技术有限公司质量研究部，利用iCIEF，对新型人乳头瘤病毒（HPV）ZL性疫苗HPV16E7-HBcAg-Hsp65融合蛋白的等电点，进行图谱鉴定。

Characterization and evaluation of the immune responses elicited by a novel human papIllomavirus (HPV) therapeutic vaccine: HPV16E7-HBcAg-Hsp65 fusion protein, J Virol Methods, 197, 1-6 Mar 2014.

2.活体脊髓灰质炎病毒等电点检测

荷兰转化疫苗研究所利用iCIEF，观察不同批次，以及不同储存形式的1型PV（polio vaccine） Mahoney菌株培养的活体脊髓灰质炎病毒等电点的分析。从而判断不同批次间病毒的pI测定的可重复性以及冻存对病毒pI值的影响。结果显示，利用iCIEF观察到，不同批次A-D之间的pI峰型是可比较的。且新鲜样品A与存储在-80°C的批次B-D，在对病毒pI峰型上没有影响。

利用iCIEF，观察不同菌株培养的脊髓灰质炎病毒pI峰型图。为后续工艺开发，建立不同脊髓灰质炎病毒种类的pI表征图。

Isoelectric point determination of live polioviruses by capIllary isoelectric focusing with whole column imaging detection,Anal Chem, 85 (12), 6089-94 2013 Jun 18.

3. 诺如病毒病毒样颗粒等电点分析

加拿大圭尔夫大学食品安全研究所利用iCIEF，观察6个不同种类的诺如病毒病毒样颗粒（norovirus virus-like particles, VLPs）的pI峰型图。可以观察到每个VLP都有一个主峰（用于确定pI）和几个小峰。后续研究发现，不同颗粒大小的VLP可以呈现不同的pI值。由于颗粒的不稳定，可以降解形成不同分子量的切割产物，因此构成峰形图中的小峰。

利用iCIEF观察诺如病毒病毒样颗粒的pI峰重现性。结果显示，利用iCIEF检测到诺如病毒病毒样颗粒的pI峰重现性很好。

Isoelectric Point Determination of Norovirus Virus-Like Particles by CapIllary Isoelectric Focusing With Whole Column Imaging Detection, Anal Chem, 76 (1), 48-52 2004 Jan 1.

4. 脂质纳米颗粒疫苗表面电荷表征

脂质纳米颗粒（LNP）除了用于小分子，siRNA，mRNA和pDNA的药物递送，还被用于ZL和疫苗的研发。

Merck疫苗分析和开发部门diyi次基于成像毛细管等电聚焦（iCIEF）表征LNPS包装的mRNA的疫苗。他们利用iCIEF，通过对两性电解质以及甘油的添加来优化检测LNP的表观pI。确定好优化条件后，对不同LNP样品的三种独立制剂之间的pI进行重复性检测，结果显示三次样品的峰形保持一致，重现性很好。通过测试了五种浓度的mRNA的LNP样品的pI，使用线性回归分析，将标准品（LNP）的峰面积对mRNA浓度（μg/mL）作图。结果显示，该线性范围的测定系数（R2）为0.997，显示出很强的线性度，证明了该技术进行定量分析的能力。

配制不同的LNP批次，每个批次包含不同的阳离子脂质与mRNA的比率（摩尔/摩尔）。利用iCIEF对所有制备的LNP的进行表观pI检测，然后将pI值与阳离子脂质和mRNA浓度作对数图。结果显示，LNP表观pI与阳离子脂质浓度有很强的相关性，R2 = 0.956，但与mRNA浓度相关性很弱，R2 = 0.653。揭示了阳离子脂质位于LNP表面，而mRNA位于LNP内部。且LNP充当保护mRNA的保护性疏水屏障。

利用iCIEF检测有无装载mRNA的LNP的表观pI。结果显示，带有和不带有mRNA的LNP在大约7.7处具有相似的pI。但包含mRNA的LNP的峰面积大于不包含mRNA的LNP的峰面积。这可能是散射光和mRNA吸光度组合的原因。

为了证明LNP的表观pI取决于LNP表面的阳离子脂质，用iCIEF检测两种不同pKa的阳离子脂质的LNP的pI。结果显示，LNP的pI分离是基于阳离子脂质pKa值。用iCIEF方法可用于鉴定LNP样品中的阳离子脂质。

用iCIEF方法可以检测热应激时LNP的稳定性。结果显示，随着温度的升高，未装载mRNA（图B）的LNP出现轻微的酸移和尖峰，意味着空的LNP随着温度的升高产生不稳定或者发生聚集。装载mRNA的LNP（图A）随着温度的升高，“酸性变异体”与主峰基线分离得越大。这可能是由于温度的升高，mRNA暴露在LNP表面而造成的。

Development of an imaged capIllary isoelectric focusing method for characterizing the surface charge of mRNA lipId nanoparticle vaccines, Electrophoresis, 40 (18-19), 2602-2609 Sep 2019.

5.重组乙肝疫苗制剂稳定性研究

Merck疫苗研发ZX，利用iCIEF考察重组乙肝疫苗，在3种不同制剂缓冲液及不同冻融次数情况下，等电点变异以及图谱稳定性。从而判断疫苗制剂缓冲液的稳定性。结果显示，利用iCIEF观察到，从制剂缓冲液A到C这三种制剂中的pI值2.7均没有变化。但在1x~5x冻融循环后，在制剂缓冲液B和C中观察到了spikes峰，但在制剂缓冲液A的峰型仍然很稳定。因此，与配方缓冲液B或C相比，配方缓冲液A为HBsAg提供了Z稳定的缓冲体系。

Development of Imaged CapIllary Isoelectric Focusing (iCIEF) method and Use of CapIllary Zone Electrophoresis (CZE) in Hepatitis B Vaccine (RECOMBIVAX HB®). Electrophoresis, 35 (7), 1072-8 Apr 2014.

6.结合疫苗载体蛋白的验证、工艺评价、稳定性研究

对CRM197蛋白的验证除了可以通过将pI值和电泳图谱与参考标准谱图相匹配，此外，可以通过结合靶向CRM197的mAb来阐明该CRM197蛋白的特异性。

Merck疫苗分析开发研究实验室，利用iCIEF观察，在用其特异性抗CRM197 mAb滴定CRM197时，电泳图谱发生的变化。结果显示，电泳图谱以约1：1的摩尔比时停止变化。另外，此CRM197的酸性峰也与其主峰一起移动，表明这些酸性形式在与其抗CRM197 mAb结合方面也具有活性。

利用iCIEF评价CRM197的上游和下游工艺。结果显示，上游样品S1和S2的浓度测量结果的RSD<15％，样品S3和S4的RSD<5％。体现了iCIEF方法的高分辨率，以及可以用于快速筛选Z高的细胞克隆生产者和Z佳的发酵条件，以提供Z大的CRM197效价。

利用iCIEF监视贮存过程中蛋白的电荷异质性，作为产品稳定性评估的一部分。结果显示，在3个月的存储期间（22℃），CRM197的酸性峰（pI 5.77和5.82）增加，而主峰（pI 5.9）降低。

利用iCIEF观察CRM197在四个不同温度下三个月的稳定性曲线。在22℃（红线）下，酸性峰面积增加，主峰面积减少；在4℃（蓝线）下，酸性峰面积增加慢得多，表明在此温度下三个月内略有降解。在-20℃（绿线，）和-70℃（黑线）的酸性峰没有变化，表明此CRM197在这两个温度下非常稳定。

Use of imaged capIllary isoelectric focusing technique in development of diphtheria toxin mutant CRM197, Electrophoresis,35 (7), 1065-71 Apr 2014.

Merck生物制剂和疫苗研究实验室，利用iCIEF的280nm紫外吸收和荧光模式，检测不同发酵条件下，疫苗常用载体蛋白CRM197的pI差异。结果显示，在吸收光模式下，S1和S4没有从其它杂质中分离出来。但是在荧光模式下，所有四个样品中均清楚地观察到CRM197，体现了iCIEF荧光模式下更高的灵敏度和选择性。

Quantitation of CRM197 using imaged capIllary isoelectric focusing with fluorescence detection and capIllary Western, Anal Biochem, 534, 19-23 2017 Oct 1.

（来源：ProteinSimple）