验证微型缓释泵的精确度 | 瑞沃德植入式缓释泵技术干货七

       为验证缓释泵是否在实验过程中连续给药，建议RWD缓释泵的用户在整个给药过程中的几个时间点检测药物的血液浓度。如果不可能检测循环血液中的浓度，或技术上不可行，还有几种替代方案可供选择。

       注意，未装满或已排空的泵的重量不能用于检测药物泵出量，因为此时的泵会在工作时吸收水分。类似的，通过切开已用过的缓释泵来判断泵的性能，也是一种不可靠的方法。

A. 平均泵送率的测定

       RWD缓释泵的储药仓比要求的容量稍大，以便能完成整个3天的泵送工作。因此，在泵停止工作后，泵内会残留有一些药液。可使用附带的平头灌充针和1.0ml注射器将这些溶液抽出，并用额外的溶剂冲洗来收回残留的药液。随后即可使用合适的方法对回收药液中的目标药剂进行分析。平均泵送率等于Z初灌充到缓释泵中的药液量，减去结束后泵中的残余药液量，再除以泵送时间。

B. 体外泵送率的测定

       RWD缓释泵有确定的泵送速率，该速率通过将泵置于37°C（± 0.5°C）的等渗盐水中测出。如果用户需要自行检测泵送率，建议遵照以下步骤：

       步骤1：制备一种已知浓度的指示剂等渗盐水溶液。通过缓释泵泵出的指示剂的量，即可算出泵送率。因此，指示剂溶液应与泵的材料相容，且能在溶于等渗盐水时方便地进行分析。（可使用美国FD&C 1号蓝色染料） 

       步骤2：使用指示剂溶液灌充RWD缓释泵。

       步骤3：将RWD缓释泵放入预先已注入15ml等渗盐水的试管中，在37°C（± 0.5°C）的温度下进行预保温处理。盖住试管，以防蒸发。

       步骤4：记录下保温的开始时间，保温6-8小时。

       步骤5：将缓释泵移入新的等渗盐水的试管中，每隔12小时将RWD缓释泵转移到一个新的注入有15ml等渗盐水的试管中。记录下转移的准确时间和/或两次转移之间的间隔。

       步骤6：连续3天时间重复步骤5。

       步骤7：对比已知的浓度标准分析每个试管中指示剂的浓度，计算每个时间间隔内泵出的指示剂的量。根据这一指示剂量和Z初灌充入RWD缓释泵内溶液的指示剂浓度，即可计算出每个间隔泵出的溶液总量。除以每间隔的小时数即可获得每小时的容量泵送率。注：如使用的是FD&C 1号蓝色染料，建议分光光度分析的波长为630nm。

       RWD微型缓释泵可植入到（至少20g重的）动物的皮下。皮下植入时，需先在肩胛骨之间的皮肤上做一小切口。使用止血钳分离皮下结缔组织，形成一处空隙。将泵置入空隙中，流量调节器不要指向切口。皮肤切口可以使用伤口夹或缝线缝合。

       腹腔植入时，在（体重至少为150g的）动物的胸廓下腹中线做一小的皮肤切口。直接向下切开腹肌做另一小切口。将泵植入，流量调节器朝里放入。用缝线缝合肌肉切口，皮肤切口可以使用伤口夹或缝线闭合。需注意的是药物释放期结束、或植入第4*天后必须取出泵。

（*参看系列文章来计算准确的释放时长，以及本批次微型缓释泵的Z长容许置入时间。）

RWD微型缓释泵的工作原理

瑞沃德植入式缓释泵

       RWD缓释泵是一种精确的给药工具。本节将详细说明本批次2003D型缓释泵的实际泵送率和灌充量规格，以及确定具体数值的方法。在6-8小时的启动过渡后，2003D型缓释泵能以恒定的速率（在可预测范围内）将药液泵释放，直到储液仓内只剩5%左右的溶液为止，然后速率下降为零。

       RWD公司用来估算渗透泵泵送率的方法是在体外检测37℃（± 0.5°C）0.9%盐水中缓释泵的泵送速率。这一体外测试法具有良好的可再现性，不管是针对不同时期同一批缓释泵还是不同批次缓释泵的测试，用来估算泵在恒温动物（0.9%盐水为等渗溶液）体内的预计泵送率。例如，在大鼠和小鼠中，植入的微型缓释泵在皮下或腹腔内的泵送率和体外速率的的偏差在5%之内。

A. 体外合格性试验

       从本产品的同一批次中随机选出了20个RWD缓释泵。这些泵请使用后文方法灌充入染料溶液。平均灌充量值，包括标准差见产品标贴。

       在灌充完染料溶液后，将所有RWD缓释泵浸入37°C（± 0.5°C）0.9%的盐水中。八小时后将这些泵再放入装有新鲜盐水的试管中，每12小时换试管一次，连续检测3天。对照标准对每部缓释泵的输出进行分析。在8到80小时（3天）的时间段内，每部缓释泵均以恒定的速率工作。按照RWD公司的经验，每部缓释泵的泵送率的变异系数不会超过10%。产品标签的批次规格中，还包括一个批次内所有缓释泵的体外泵送率平均值及标准差。

B. 启动时间

       如果RWD缓释泵是在室温（23°C）下灌充入同样是室温的溶液，那么放置到37℃的等渗盐水中后，其泵送率在前几个小时内无法达到稳定状态。如果试验需要立即泵送药液，RWD建议在植入前把预先充好药液的泵放入37℃的0.9%盐水中至少6-8个小时（Z好过夜）。如果泵和导管合用，或者释放的溶液为粘稠溶液时，那么必须这样做。

C.泵送时长的确定

       缓释泵的有效工作时长可按以下等式计算：

D = （V/Q）（0.90）

       在此等式中，D是泵送时间（单位：h），V是泵储液槽的容积（单位：µl，见相关规格），Q是泵送率（单位：µl/h）。

       每个缓释泵使用时都必须充满药液，正确的灌充方法详细说明如下。泵的储药仓中有气泡或未插入流量调节器可导致无法预测的泵送速率波动。灌充时药液的温度应该为室温。

       建议在灌充和操作RWD缓释泵时以及进行外科植入手术时遵守规范的灭菌方法。针对药液的CJ，可使用0.22μm的注射器针头过滤器进行过滤。

       在灌充和植入过程中，握持RWD缓释泵时应戴有手术用手套。泵的表面如果蓄积有大量皮脂，会影响到泵的性能。如果泵的表面受到污染，可在植入前使用70%的异丙醇水溶液擦拭。不要把泵浸没在70%的异丙醇溶液中。

当给RWD缓释泵灌充药液时请遵照以下步骤：

       步骤1：称量空泵（带流量调节器）的重量。

       步骤2：灌充泵时使用小注射器（1.0ml）和附带的27G平头灌充针，使用较大的注射器可能导致灌充速度过快，在储药仓内产生气泡。将药液抽入注射器内，连接上灌充针。注射器和灌充针内不能有气泡。

       步骤3：取下流量调节器，将泵竖直拿在手中，从泵顶端开孔位置将灌充针插入，直到针尖到达缓释泵底部。

       步骤4：向上提起针头1~2mm，缓缓推动注射器的活塞，缓释泵应始终保持垂直。当从出口看到药液溢出时，停止灌充，小心地移出注射器及灌充针。（灌充速度过快可导致储药仓内出现气泡。）

       步骤5：擦净溢出的药液，插入流量调节器，直到白色的法兰与缓释泵的顶端齐平。置入流量调节器时会导致一些药液溢出。擦净溢出的液体。为使缓释泵正常工作，流量调节器必须完全插入泵体。

       步骤6：给充满药液的泵称重。步骤1和步骤6的重量差就是灌充进泵中的溶液的净重。对于大多数稀释的水溶液来说，灌充重量（以mg为单位）应近似于泵的容量（以µl为单位）。灌充量应达到产品标贴上标注的平均灌充量的90%以上。如果灌充重量近似于泵容量，则可以开始使用灌充后的缓释泵了。反之，则缓释泵内可能混入了空气。这时应抽空泵，重新灌充。

       如果灌充时遇到缓释泵内部有压力，可在灌充时将灌充针稍微倾斜一些。也可前后移动灌充针将灌充口扩大一点，或者在插入灌充针前插拔流量调节器几次。

       RWD缓释泵储药仓使用材料为TPE，可相容一般水溶液药物，如果对待用药物与泵的相容性不确定，可使用RWD化学相容性试剂盒来测试溶剂和药剂是否与RWD缓释泵相容。试剂盒内有必要的泵组件材料，可在使用缓释泵前用来与药剂和溶剂做相容性试验。建议以下情况时使用试剂盒：

       1. 药剂处于游离碱状态时。

       2. 已知药剂可与各种聚合物材料发生结合时。

       使用时可在泵内产生气体的溶液也会使泵送速率变得高度不可预测。此外，有沉淀颗粒的溶液在使用前必须先过滤。

       RWD缓释泵可泵送粘度低于100,000厘泊的均匀粘稠溶液。悬浮液如果无沉淀也可用缓释泵输注。为确保均匀释放，悬浮液在整个释放过程中必须保持匀质。

       注意，除了考虑药液与缓释泵的相容性外，一定要确保选择的溶剂与用药部位的组织和液体具有生物相容性。

为了减轻动物多次给药对实验人员的负担，植入式缓释泵作为持续给药 方式的标志性产品被开发出来。缓释泵植入动物体内，通过渗透压作为动力将胶囊内储存的药液按照恒定的速度持续准确地送出，最长可持续4周时间。目前缓释泵持续给药已经被应用到多种疾病的动物模型建立, 如常见的高血压及帕金森病的动物模型，广泛应用于药物及分子筛选、药理药代药效等众多领域的研究。

缓释泵组成：

缓释泵主要由半透膜外壳，盐夹层、内部药囊和流量调节器组成；半透膜外壳允许动物体液透过，盐夹层通过高渗透压吸收体液发生膨大，挤压内部药囊从流量调节器这个唯 一的出口将药物泵出。

缓释泵内部结构图

型号选择：

缓释泵有100ul、200ul、2ml三种载药量规格，以及3天-4周不等持续时间，根据需求选择合适的型号进行实验，其中100ul、200ul系列适合成年小鼠，2ml由于体积较大适用于大鼠或其他较大动物使用。

浓度计算：

缓释泵药物浓度计算要根据每天给药量以及缓释泵的泵送速率这两个参数来计算给药浓度，其中每天给药剂量可根据事先查阅文献确定。此外，每批次缓释泵的泵送速率会贴在包装盒上，需要按照包装上的速率进行配药。

药物浓度计算：C=Kd/Qd

C表示药物浓度(ug/ul); Kd表示每天给药量(ug/d); Qd表示每天给药体积(ul/d)

例如，采用2003D缓释泵进行小鼠某药物皮下释放，查阅相关文献得知每天给药量是2mg/kg/d，实验小鼠称重30g，所以 Kd= 2mg×0.03=0.06mg=60ug；包装盒显示2003D速率2.23ul/h，所以Qd= 2.23×24=53.52ul；求得配药浓度C= 60ug/53.52ul=1.12ug/ul。

注意事项：

1、不能根据缓释泵自身体积来计算配药浓度，缓释泵实际载药体积会稍大于宣称体积；

2、泵体埋入动物体内后应在释放周期结束时取出，不能一直留在动物体内。

药液灌充：

1、将缓释泵竖直拿在手中，从顶端开孔位置插入灌充针，直到针头轻触缓释泵底部，再稍微向上提起灌充针约1 mm。

2、缓缓推动注射器，将药液灌充进缓释泵（缓释泵应始终竖直）。当在缓释泵开孔位置看到有药液溢出时，停止灌充，小心抽出灌充针。

3、将流量调节器完全插入泵体，完成灌充，之后进行孵育或埋置手术。

4、如果泵体内部引入气泡可将流量调节器拔出重新灌充。

注意事项：

1、缓释泵必须灌满，泵内不能留有气泡，否则可能导致泵送速率不稳定。

2、灌充速度不宜过快，容易引入气泡，避免使用量程较大的注射器灌充。

泵体孵育：

缓释泵初始阶段存在泵送速率不稳定的可能，为了平衡泵送速率，建议埋置前进行孵育。

1、准备50ml离心管，倒入适量0.9%无菌生理盐水。

2、把已经灌充药液的缓释泵置入其中，然后将离心管转移至37 ℃恒温箱中孵育一定时间（孵育时间根据各型号缓释泵有所不同）。

注意事项：孵育时必须让生理盐水完全没过泵体。

植入手术：

缓释泵可直接背部皮下或腹腔植入进行全身性给药；此外也可连接导管将药物引导到特定部位进行给药。

皮下植入：

1、将动物麻醉，使动物处于俯卧姿态。

2、在肩胛骨之间的皮肤上切开一个切口。

3、使用止血钳分离皮下结缔组织，形成一处空隙。

4、将缓释泵植入空隙中，流量调节器不能朝向切口。

5、使用伤口夹或缝线缝合皮肤切口。

腹腔植入：

1、麻醉动物，使动物处于仰卧姿态。

2、在动物的胸廓下腹中线的皮肤上用刀划开口。

3、镊子挑起腹肌，避免伤及内脏，然后用剪刀向下剪开腹肌。

4、将缓释泵植入切口，流量调节器不能朝向切口。

5、用缝线缝合肌肉切口，皮肤切口可以使用伤口夹或缝线缝合。

搭配导管进行特定部位给药：

以常见的脑部、颈静脉给药为例

一、脑部给药

脑区坐标

根据脑图谱或文献确定目标脑区的三维坐标：AP 值（Anterior-Posterior，Y 轴，头部到尾部）、ML 值（Medial-Lateral，X 轴，中缝到两侧）和 DV 值（Dorsal Ventral，Z 轴，背侧到腹侧）。

导管连接、灌充和孵育

1、将导管与流量调节器顶部钢管连接，截取一小段导管套在流量调节器的另一端钢管上。

2、灌药针头插到小段导管里进行导管灌药，直到插管的钢针处有药液滴出。

3、如前述步骤，采用灌注针将泵体充满药液，然后小心将同样充灌完毕的流量调节器插入泵体内，避免出现气泡。

4、如前述步骤，将泵体没过生理盐水进行37°C孵育，导管不需要没过生理盐水。

备皮，定位和钻孔：

1、小鼠诱导麻醉，转移到脑立体定位仪上进行头部固定，持续给予异氟烷。

2、镊子挑起头皮用剪刀沿中线剪开头皮，暴露颅骨。

3、定位仪夹持颅钻，将钻尖抵触颅面进行颅骨调平，确保前后左右颅面高度差＜0.05mm。

4、将颅钻定位至目标脑区进行钻孔，可同时在孔位附近钻1-2小孔用于旋入颅钉，增加牙科水泥着力点。

埋置：

1、用镊子夹住插管基座从生理盐水里取出孵育好的泵体。

2、将夹持器装在定位仪上并夹住插管基座，根据脑区坐标将插管钢针缓慢插入颅内。

3、用牙科水泥覆盖插管基座以下部分进行固定，待牙科水泥凝固之后用钳子剪断基座。

4、用止血钳自头皮切口到颈背部分离皮下结缔组织，打通皮下隧道形成空隙。

5、将缓释泵植入空隙中，使用伤口夹或缝线缝合头皮，可在皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，防止动物发炎感染。

二、颈静脉血管给药

导管连接、灌充和孵育：

如前所述。

图注：静脉插管带有结节防止滑脱

颈静脉分离：

1、麻醉动物，使动物处于仰卧姿态；

2、将小鼠右侧颈部调整至显微解剖镜视野内；

3、在小鼠锁骨颈前正中线右侧用眼科剪剪开长约1cm的纵切口；

4、眼科镊钝性分离脂肪组织，游离颈外静脉，长度约为1cm，然后在分离的静脉下方横穿双股丝线。

插管：

1、结扎远心端A，近心端B留一活结用于固定导管。

2、用剪子在两点之间45度斜着剪开一个口，长度约为颈静脉直径1/2。

3、在显微镜下将导管从斜口处插入颈外静脉内适当长度，一般约1cm，直至结节。

4、确定导管进入静脉后，将远心端A结扎线在结节后方再次结扎固定，近心端B所留活结拉紧固定以防导管滑出。

泵体埋置：

1、插管完毕后，使用眼科镊自颈前切口与背部之间打通皮下隧道形成空隙。

2、将缓释泵植入空隙中，使用伤口夹或缝线缝合头皮，涂抹罗红霉素软膏，防止动物发炎感染。

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       深脑钙成像技术在神经科学领域内的应用愈加广泛，它通过微型荧光显微镜系统，观察行动自由的动物大脑深处的神经元活动，可以更好地揭示内在的神经活动，对于理解动物行为与认知功能背后的神经编码机制变得越来越重要。

       利用微型显微镜，对于基底和外侧杏仁核(BLA)的细胞群如何编码条件刺激和非条件刺激之间关联的研究（参考文献：Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Benjamin F. Grewe et al.,  Nature. 2017）

       然而该显微镜必须与GRIN（Gradient index）Lens相结合，通过将GRIN Lens埋植在目的脑区上方，可以同时捕捉到成百上千个大脑深层区域的神经元的钙活动。在GRIN Lens植入前，需将目的脑区上方的脑组织移除，抽吸是一种广泛采用的方法。然而，典型的脑组织抽吸方法仍依赖于手持式真空针，存在人为误差和重复性差的问题。

       基于文献研究(Barbera et al.,2016; Jung et al., 2004; Pinto and Dan, 2015; Ziv et al., 2013)，强烈建议对中等深度的大脑区域，如前额叶皮层、海马和纹状体等植入1 mm直径GRIN lens的大脑区域，采用缓慢的逐层抽吸的方式进行脑组织抽吸。

       为此，我们为大家提供了一种高精度的脑组织抽吸自动化手术仪器—自动透镜植入定位仪。

       该仪器通过电脑软件精确控制步进电机，进而驱动定位仪操作臂移动，并结合真空泵自动jing准的移除脑组织，以便更好地埋植透镜。

       与传统手动方法相比：它可以大大减少人为误差，缩短实操训练时间，大大提高手术精度和效率。

参考文献：An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Bo Liang. Lifeng Zhang et al, Journal of Neuroscience Methods 2019

       这非常有助于神经科学工作者或研究者利用微型显微镜或双光子显微镜结合显微内窥镜进行活体脑深部成像。

       此外，该设备在体电生理手术实验过程中，可通过设置电机移动速度，非常jing准缓慢地埋植电极，帮助实验者快速记录细胞信号。

       当然，你也可以把它当做普通的电动定位仪来使用，常规的脑部注射等实验都可以用它来完成。

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1、结构设计合理，可同时监测气体参数和可吸入颗粒物、气象参数等，标配监测参数为PM2. 5、PM10、 NO2、S02、03、CO六项，俗称“两尘四气”；

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3、采用进口高灵敏度的传感器，响应速度快，分辨率高，线性好，检测下限可达ppb级，高温条件下稳定运行；

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5、实现各类参数采集、 自动上传网络平台，手机客户端实时查看数据；

6、集成GPRS无线通讯技术，实时监测大气环境数据，成本低，适合网格化布点；
7、可选配GPS定位，实现设备跟踪功能； 
8、可选配太阳能供电，实现太阳能、市电互补；
9、 性能稳定、精确度高、操作方便、易于维护，具有掉电保护功能；
10、精度高、性能可靠，适用于户外和工业环境领域。

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7、国外原装进口四电极气体传感器，性能稳定、分辨率高；
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10、实时通过无线网卡上传到云平台上，进行大数据分析；
11、扩容性强，气体，气象五参数，噪音等都可选配；
12、配件齐全，太能阳供电，固定支架等应有尽有；
13、环境使用范围广，风沙、 雨雪及扬尘等恶劣天气均可。

      近年来，随着各行各业对真空泵的微型化、不污染工作介质等特性的进一步要求，体积小巧、无油免维护、低噪音、可直流供电的微型真空泵得到了越来越广泛地使用。

       微型气泵通常有两种，一种是微型正压泵，另外一种是微型负压泵，先来了解下什么是微型正压泵和微型负压泵。

       微型正压泵一种可打气或用于排气阻力很大的气路系统；转移气体、加速气体流动、增压等的仪器，其原理是：电机的圆周运动，通过机械装置使泵内部的隔膜做往复式运动，从而对固定容积的泵腔内的空气进行压缩、拉伸形成真空(负压)，在泵抽气口处与外界大气压产生压力差，在压力差的作用下，将气体压(吸)入泵腔，再从排气口排出。

       微型负压泵是指能产生负压的微型气泵，即具备一进一出的抽气嘴、排气嘴各一个，并且在进口处能够持续形成真空或负压；排气嘴处形成微正压；工作介质主要为气体，体积小巧的一种仪器。也即常说的“微型真空泵”。其工作原理是：电机的圆周运动，通过机械装置使泵内部的隔膜做往复式运动，从而压缩、拉伸泵腔内的空气形成负压，在抽气口处与外界大气压产生压力差，在压力差的作用下，将气体吸入泵腔，再从排气口排出。

       正压泵跟负压泵有很大的不同。比如气体流向，负压泵是外部气体被吸入到抽气嘴;正压是从排气嘴喷出去;比如气压的高低等。负压泵主要用于对真空(负压)有要求的场合，比如：抽气、气体分析、气体循环、气体采样、真空吸附、间接吸水等;而正压泵主要用于需要泵作为动力，进行气体转移、对密闭容器增压、充气打气、间接压水等，两者常用于YL、科研、环保、仪器、控制等等方面。

       简单地说,负压泵就是抽气泵,正压泵就是充气泵,两者的联系是,与容器的接口方向相反.这是因为每一个泵都是一个进气口,一个出气口,正接充气,反向接抽气.一泵二用。

（内容来源于网络）

Q1 

怎么设定麻醉动物的流量？

       动物的麻醉效果除了与蒸发器设置浓度有关，也与流入动物的氧流量有关。通过下面的列表可以看出，当蒸发器设定浓度为2%，测量兔子的呼气末异氟烷浓度的差异，一般流量越大，动物呼气末异氟烷浓度越大。

       根据我们测量和经验总结：一般建议小鼠氧流量为0.3-0.5L/min，大鼠为0.5-0.7 L/min，具体的流量根据动物的麻醉状态适当上下调节。非啮齿哺乳动物要高很多，跟动物的体重有关，也根据选择的呼吸回路相关。

Q2

如果需要同时麻醉多只动物，

怎么独立控制每只动物的麻醉流量？

       采用R510-07五通道流量计！把麻醉机快速升级为五通道麻醉机，不仅可以麻醉五只动物，而且每个通道可以独立调节气体流量，达到每只动物麻醉状态的独立调节。

五通道流量计

Q3

麻醉效果与蒸发器浓度相关，

那怎么调节麻醉机的浓度？

       蒸发器浓度的调节与蒸发器种类和麻醉剂有关，一般动物麻醉选用的是异氟烷和七氟烷的蒸发器和麻醉剂，并且在诱导时和麻醉维持时，浓度调节不一样，具体如下：

蒸发器

Q4

每次做实验时，要倒入多少麻醉剂呢？

       一般在使用麻醉机前，需检查蒸发器麻醉药的剩余量，确保麻药的容量在蒸发器示液柱刻度线之间，根据实验长短适量增加。 

       如果是新机首次使用，可以一瓶100ml的麻醉剂全部倒入蒸发器中，避免反复加药。瑞沃德的蒸发器容量为120ml，且做过3个月的密封性检测，不用担心蒸发器关闭时，麻醉药泄露。 

Q5

清空诱导盒内的麻醉气体需要多久？

       啮齿动物从诱导盒取出时，里面会有大量麻醉药残留。可通过麻醉机的快速充氧开关稀释诱导盒的麻药，避免实验人员打开诱导盒时吸入麻醉药。

       依据快速充氧速度10L/min 和诱导盒的体积，瑞沃德麻醉机快速充氧清空诱导盒内麻醉气体，参考时间如下：

       小鼠诱导盒约9秒。

       大鼠诱导盒约30秒。

       兔猫诱导盒2分钟以内。

       大动物诱导盒2分钟以内。

诱导盒

Q6

麻醉机配的回收器的风速调为多少？

       回收器的流速不同，产生气体的抽力也不同。使用回收器既能确保面罩处可以维持动物麻醉，又避免麻醉废药泄露到环境中。

回收器

       瑞沃德的回收器风速为35-60LPM，且大小可调。一般使用面罩麻醉单只啮齿类动物时，回收器风速推荐R档。可根据现场使用的面罩及通道数和流量计流量适当调节，确保麻醉废药被充分回收。以下是瑞沃德一款面罩与回收器的使用的测试结果。