Orbitrap技术洞悉病毒结构

面对来势汹涌的疫情，全国上下正在积聚力量，全力战胜新型高致病性冠状病毒（2019-nCoV）。疫情研究者一样没有停下自己的脚步，特别是在分子水平，我们调研了基于Orbitrap超高分辨的蛋白质组学和结构学技术在病毒学研究中的应用，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。

赛默飞一直致力于提供产品解决科研难题，随着Orbitrap高分辨质谱的不断创新与突破，同时拥有蛋白质组学和结构生物学完整解决方案，其广泛应用于自然科学和生命科学的各个方面，同样在病毒学中发挥着重要作用，能够解析病毒衣壳蛋白结构、构象、装配及与宿主蛋白相互作用结构域，并实现数百万道尔顿的完整病毒的直接分析，即全面分析从病毒的组装到病毒与宿主的相互作用方式。本期我们主要介绍基于Orbitrap超高分辨质谱的非变性质谱(Native MS)、氢氘交换质谱(HDX-MS)在病毒结构学中的应用。(Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(36): 8248-8262.)

Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(36): 8248-8262

Native MS在病毒蛋白组装中的应用

非变性质谱（Native MS）即保证被分析病毒或蛋白处于非变性状态，维持其原有的空间构象，通过高分辨质谱获得完整病毒颗粒或蛋白、蛋白复合物的分子量，用于研究病毒蛋白组装、加载蛋白的化学计量学、病毒异质性和病毒蛋白与宿主蛋白相互作用等领域；

案例一：Orbitrap技术洞悉病毒的蛋白组装

准确的质量分析为研究病毒的蛋白组装过程提供重要的信息，本文使用Orbitrap高分辨质谱仪测定高达4.5MDa病毒样颗粒，并jing准检测装载8至12种蛋白后的细菌胶囊颗粒的分子量，确定加载蛋白的具体数目。此外利用Native MS技术确定腺相关病毒衣壳蛋白的三种不同剪接变体的未知化学计量，表明对称性被破坏且病毒装配过程具有异质和随机性。这些结果证明Orbitrap高分辨质谱在基于蛋白质的纳米颗粒分析中的强大能力及在化学生物学和纳米技术中的广泛应用。

基于Orbitrap分别对encapsulin, adenovirus dodecahedron, adeno-associated virus serotype 1及 cowpea chlorotic mottle virus（自上而下）分子量的测定

案例二：Orbitrap技术解析病毒异质性

本文利用Orbitrap高分辨质谱解析具有挑战性的天然和生物ZL性蛋白的组装，如核糖体颗粒、基于蛋白质的纳米颗粒，及分析病毒组装的异质性，区分加载不同基因组或片段的病毒颗粒，为病毒性质和质控提供重要信息。

基于Orbitrap高分辨质谱测定不同质量大小的蛋白及核糖体、颗粒，并区分空壳和基因加载腺病毒颗粒

HDX-MS在病毒结构学中的应用

氢氘交换质谱（HDX-MS）即将非变性的目标蛋白、蛋白复合物、病毒衣壳蛋白置于氘水中，放置不同时间后取出进行猝灭，在完整蛋白或多肽水平进行质谱测定，通过观测氢氘交换速率的变化来确定蛋白或病毒衣壳蛋白空间结构变化以及衣壳蛋白与宿主蛋白相互作用区域。

相比于经典的结构学研究技术，无需大量的样本及复杂的晶体制备，对样品要求较低，能够实现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息，使得Z终的蛋白质高级结构的信息更加全面和准确。

案例一、HDX-MS探测病毒衣壳蛋白空间构象变化

如利用HDX-MS能够解析体内感染过程中病毒衣壳蛋白的构象变化^[1]，实验中二十面体病毒衣壳由大量对称蛋白亚基组成，其局部变化或运动对感染至关重要。在小鼠微病毒的衣壳中，感染过程涉及肽通过衣壳孔的移位，导致构象变化，在体外实验中通过适度的加热衣壳诱导这种变化，但对该过程构象变化的研究依赖于经典结构生物学技术，仍有待明确的信息，该实验利用HDX-MS方法（实验流程如下图）揭示衣壳孔具体区域的结构重排并涉及整体构象改变。同时该实验证明了HDX-MS在大分子蛋白质组装物中的应用前景，及为病毒颗粒中进行结构、动力学和生物学功能之间关系的研究提供新颖的解析手段。

研究病毒衣壳蛋白空间变化的HDX-MS实验流程

案例二、HDX-MS研究病毒蛋白与宿主因子的动态相互作用

诺如病毒在组织血型抗原（HBGA）上的附着对于感染至关重要，但两者如何结合促进宿主细胞的感染尚不清楚，本文利用NMR和HDX-MS（Orbitrap Fusion系列质谱仪）技术研究HBGA与流行病毒株Gll.4的P结构域的结合。结果显示两者的结合具有高度的选择性，取决于位于与HBGA结合位点相邻的抗原环中373位的天冬酰胺转化为异天冬氨酸，在生理条件下此抗原自发性翻译后修饰的半衰期持续多天，且与HBGA的存在无关，但严重影响HBGA的识别。该翻译后修饰序列的保守性和位于病毒的表面位置，表明在许多诺如病毒株的感染和免疫识别中起着重要作用。

利用HDX-MS技术揭示GII.4 Saga P-dimer 373位天冬酰胺转化对蛋白质动力学的影响

非变性质谱（Native MS）研究方法

氢氘交换质谱（HDX-MS）研究方法

参考资料：

[1] Van de Waterbeemd M, Llauró A, Snijder J, et al. Structural analysis of a temperature-induced transition in a viral capsid probed by HDX-MS[J]. Biophysical journal, 2017, 112(6): 1157-1165.

（孙佳楠 周岳）