IVIS视角——[Nature]亚克隆合作通过修饰局部和全身的免疫微观环境驱动肿瘤转移

肿瘤异质性及转移性

人类大多数肿瘤是异质性的，由具有不同性质的细胞克隆组成，呈现出不同的特点。高度异质性肿瘤具有较差的临床LX，但其潜在机制仍不清楚。肿瘤的转移性是大多数癌症患者死亡的原因。因此，了解转移进程的驱动因子是改善临床结果的关键。

癌症基因组测序研究已经确定了原发性和转移性肿瘤之间具有极小的遗传差异，并显示原位肿瘤和远处转移病灶具有显著的亚克隆异质性。Z近的一些研究表明：微观环境变化是肿瘤转移传播和生长的主要媒介，从而突出了在肿瘤进展中的非细胞自发因子的作用。

本期IVIS视角小编带您探究一下NatureZ近发表的论文：《亚克隆合作通过修饰局部和全身的免疫微观环境驱动肿瘤转移》

本文揭示了表达IL11和FIGF (VEGFD)的乳腺癌细胞的小亚克隆协同作用促进转移进展并产生了驱动性和中性亚克隆组成的多克隆转移。单克隆、多克隆原发灶和转移灶的上皮细胞及基质细胞表达谱分析显示了这种协同作用是间接的，是通过局部和系统微环境介导的。作者确定中性粒细胞为主的白细胞群受表达IL11小亚克隆的调节，敲除中性粒细胞的表达，可以阻止肿瘤转移的生长。来自原发性肿瘤、血液和肺的CD45阳性细胞群的单细胞RNA-seq显示IL11作用于骨 髓间充质基质细胞，可诱导产生致瘤性和转移性中性粒细胞前体。本文结合IVIS活体成像系统研究发现了非细胞自发因子和小亚克隆在肿瘤转移中起着关键作用。

探究驱动转移的亚克隆协同作用分子机制

本文用人类乳腺癌细胞系(MDAMB-468)的肿瘤（来源于异质性肿瘤异种移植模型），研究亚克隆在肿瘤表型之间的相互作用。作者之前已经证实一个小的亚克隆通过非细胞自主的相互作用可以驱动肿瘤生长。本文测试了18个亚克隆，每一种表达一种与转移和血管再生有关的分泌蛋白。并发现具有全部18个亚克隆的多克隆肿瘤生长Z快（上图a）。相反只有白细胞介素11 (IL11) 和趋化因子 (C-C motif) 配体5在单克隆肿瘤能够促进肿瘤生长。我们还确定了表达IL11和低聚果糖诱导生长因子（FIGF也被称为VEGFD）的亚克隆两者的混合物在很大程度上能够复制肿瘤这种生长特点。

克隆之间合作导致多克隆转移

Nature Cell Biology :Published: 01 July 2019

https://www.nature.com/articles/s41556-019-0346-x

IL11缺失的多克隆肿瘤阻止了肿瘤的生长，揭示了IL11和FIGF因子在肿瘤生长中的协同作用。此外，多克隆肿瘤和仅包括IL11和FIGF亚克隆的肿瘤具有高度的转移性（上图b）。

本文首先验证含有IL11+和FIGF+驱动因子的原发性转移瘤MDA-MB-468的克隆能力，像中性子亚克隆。单克隆或绿色荧光蛋白 (GFP)的多克隆混合物荧光素酶表达亲本细胞，红色荧光蛋白 (RFP)植入v5标记的IL11+细胞、RFP+FIGF+细胞植入到免疫缺陷NOG小鼠的乳腺脂肪垫。我们每周用卡尺测量原发肿瘤的生长情况并通过每周生物发光观察转移病灶成像。多克隆肿瘤（含5% IL11+、5%的FIGF+RFP+细胞和90%的GFP+亲本细胞）生长较快，转移性更强与单克隆和亲本肿瘤相比（如下图a）。

中性粒细胞的系统性表达降低YZ了由IL11+和FIGF+亚克隆驱动的多克隆肿瘤的转移扩散(或生长)，因此，中性粒细胞的表型和功能特点取决于宿主环境。

CD45+细胞群的单细胞分析

鉴于作者之前的结果表明，中性粒细胞促进肿瘤转移。作者比较了DOX+或DOX-诱导小鼠血液和肺中性粒细胞单细胞转录组特点。IL11和FIGF诱导上调了几个信号通路如：TGFβ和JAK-STAT信号通路，它们与中性粒细胞的免疫系统中肿瘤预生成和预转移有关，这些特征来自肺部，而不是来自血液。尽管中性粒细胞在肺部有变化，作者通过single-cell RNA-seq没有检测到IL11或GIGF受体的表达。然而，IL11RA的细胞转录本在单独的细胞组中明显存在，这些细胞不能归为中性粒细胞或其他白细胞亚群。

这些IL11RA阳性细胞表达编码GP130和SATA3的IL6ST基因，GP130是IL11信号通路中所必需的共同受体。STAT3是LI11下游的作用因子。基于细胞群中基因表达情况，其中还包括细胞外基质和发育相关蛋白，作者将该群体标记为和IL11反应的间充质基质细胞 (MStrCs)。虽然这个群体没有表达典型的间充质干细胞 (MSC)标记物，但其表现了普遍存在于干细胞相关基因的显著特征，这表明它可能是一种未特征化的间充质干细胞前体。之前的研究已经描述过间充质干细胞与白细胞之间的相互作用由多种细胞因子和趋化因子调节的。

在本文的研究中，作者着重于研究两个分泌因子，选择的基础是基于作者之前的数据，它是由较小的亚克隆表达的且协同作用促进转移。IL11属于IL6家族的细胞因子，并在多种癌症的耐药性进展中起着重要的作用，包括前列腺癌和结肠癌。在乳腺癌中，IL11被认为和ZL的耐药性和骨转移相关，以及作为不良预后的标志物。FIGF是VEGFR2和VEGFR3的配体，可以刺激血管生成和淋巴管生成。

本文发现白细胞可能不是IL11直接作用的细胞靶点，但可通过间充质基质细胞分泌因子（MStrCs）间接影响IL11。有趣的是，这些基质细胞也表达PLXDC2和ANTXR1，这在肿瘤相关的内皮细胞中是高表达的。因此，这些IL11RA阳性的间充质基质细胞可能是产生多种细胞类型的祖细胞。对中性粒细胞亚型的进一步认识和开发导致肿瘤转移的中性粒细胞靶向工具结合抗肿瘤细胞靶点的药物，有可能被用于预防乳腺癌转移研究。

PerkinElmer IVIS小动物活体成像系统在该研究中提供了支持，如需了解详情欢迎与我们的工程师取得联系。

复制右方链接了解IVIS小动物活体成像系统：https://url.cn/5fSl2r4

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

在往期分享中，我们介绍了IVIS成像系统在动物水平的众多应用，其实IVIS同样可以用于全植物成像。此次我们就分享IVIS在水稻氮代谢研究中的应用。

氮是植物生长发育所必需的养分，但其在土壤中的浓度往往达不到Z佳作物生长浓度。因此，提高作物氮素利用率被认为是农业生物技术的一个主要目标。然而，关于作物氮代谢仍有许多需要了解的地方。

在此，研究人员开发了一个分子传感器系统来监测水稻中氮的状态，该方法发表在《Frontiers in Plant Science》杂志上。研究中首先利用该系统研究了尿囊素的作用，尿囊素分解为尿囊素衍生的代谢物，在低浓度下作为氮源使用。参与尿素代谢的两个基因尿囊素酶(OsALN)和尿素渗透酶1 (OsUPS1)，对氮状态高度敏感，在低氮条件下，OsALN迅速上调，而高氮条件下OsUPS1表达上调。基于上述机制，研究人员培育了含有氮分子传感器系统的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]转基因水稻。这种转基因的表达可以模拟内源性的转录调控，即OsALN和OsUPS1基因对外源N状态的响应。

文中使用两种方法来测定分子氮传感器的能力：

方法一：在长期培养中，转基因水稻植株在高浓度氮源培养基(GM+N)或不含氮源的生长培养基(GM-N)中培养5天，随后使用IVIS活体成像系统进行成像及定量。

结果显示，生长在GM+N培养基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表现出更高的荧光素酶活性（图1A）。为了对发光信号进行定量，研究人员测定了5个独立的纯合系（具有单个基因拷贝）。生长在GM+N培养基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株发光信号强于GM-N组20倍，而强于对照组约2,800倍（图1B）。

方法二：在短期培养实验中，转基因水稻植株先在GM-N培养基中培养4天，第5天在加入100nM硫酸铵。结果显示，同长期实验结果一样，生长在后期加 氮培养基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，发光信号更强（图1C）。同样对5株独立的纯合系进行了定量，生长在后期加N培养基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物发光信号强于GM-N培养基中约50倍，而强于对照组13,000倍（下图1D）。

图1.在高氮培养条件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很强的发光信号。

(A)对照组和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培养基 中培养5天；

(B)5个独立的纯合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)条件下，发光定量结果；

(C)对照组和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生长5天, 或者在GM–N培养基中生长4天，然后加入100 mM硝酸铵培养1天；

(D)5个独立的纯合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)条件下的定量结果，以对照组作为基准进行标准化 。

这些结果说明，proUPS1::UPS1-LUC2 传感器能够通过发光信号水平检测外源氮的情况。

同样在研究中对proALN::ALN-LUC2 植株进行了相同的处理。结果显示，在长时间的培养实验中，GM+N和GM-N培养基生长的proALN::ALN-LUC2 没有明显差异（图2A）。对5株独立的纯品系进行发光信号定量，相比GM+N培养基，GM-N培养基生长的proALN::ALN-LUC2 植株发光信号要高约1.8倍，比对照组高约17倍（图2B）。因此很难鉴定GM+N和GM-N培养基对生长的影响。而在短时间培养实验中，连续生长在GM-N培养基中的proALN::ALN-LUC2，发光信号要强于加高氮培养1天的。

图2.在低氮培养条件下，proALN::ALN-LUC2 植株显示强的生物发光信号。

(A)对照组和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培养基中培养.；

(B)A组相对定量结果；

(C)对照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培养5天，或者在GM–N培养基中培养4天，然后加入100 mM 硝酸铵再培养1天 ；

(D)C组相对定量结果；GM–N培养基生长的对照组植株作为基准进行标准化。

此外，在文章中，还利用IVIS活体成像系统，探讨了该传感器对于氮源是否具有选择性及对于氮源的敏感性。结果显示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 对于氮源无特异性，可以广泛的作为水稻等植株中分子氮的传感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸铵、硫酸铵或硝酸钾浓度> 1mM即表现出强烈的生物发光信号，而低氮浓度(< 0.01mM)信号减弱。0.1mM硝酸钾proUPS1:: UPS1-LUC2 植株诱导强烈的生物发光信号，而0.1mM硝酸铵和硫酸铵则没有。这表明， proUPS1::UPS1-LUC2 传感器监测高氮状态，低氮状态。proALN::ALNLUC2 在低氮浓度(<0.1 mM)下表现出较强的荧光素酶活性，而在高氮浓度下表现出较弱的活性(> 10mM)。

综上，分子氮传感器的信号反映了分子氮的内部状态。结合IVIS活体成像技术，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作为分子传感器在不同研究中监测大米内部氮状态。

文献来源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.

肿瘤在体内只有一个目标，就是不停地生长！生长！生长！在生长的过程中不可避免的要消耗掉大量的氧气和营养物质，所以肿瘤会构建自身的血管网络系统用于养分和氧气的输送，这些肿瘤内部搭建的血管就是肿瘤的能量供应站。因此切断肿瘤的主动营养供应，破坏肿瘤的能量代谢系统，就能YZ肿瘤细胞的增殖，从而“饿死”癌细胞。

但是，这种能量切断不是广义上的让病人减少进食，或者少吃营养的东西，这样会使正常组织得不到足够的能量导致免疫力下降。真正的饥饿疗法具有选择性，可以特异性的YZ肿瘤细胞的代谢过程（图1），实现对肿瘤的jing准致命打击。

图1 特异性YZ肿瘤细胞能量代谢

级联纳米酶靶向肿瘤“饥饿”环境

通过级联纳米催化药物的设计，将葡萄糖氧化酶(GOx)和过氧化氢酶(CAT)通过pH响应的聚合物交联形成级联纳米酶，通过血清蛋白将纳米酶和抗肿瘤前药复合形成纳米药物。肿瘤的酸性环境可以将纳米酶释放，COx迅速消耗肿瘤细胞内的葡萄糖和氧气，产生饥饿和缺氧环境，切断肿瘤能量供应的同时提升前药系统的化学治LX果，并且消耗葡萄糖产生的毒副产物H₂O₂也可以快速被CAT分解，以避免产生全身毒性。这种结合靶向饥饿环境并结合缺氧化学ZL的方案可以有效YZ肿瘤细胞的增殖，不会产生毒副作用，通过小动物光学成像可以清楚的看到级联纳米酶颗粒在肿瘤部位的富集随时间的变化情况，以及48小时后纳米酶颗粒在各个脏器中的分布情况。

图2 基于级联纳米酶的纳米药物设计以及在体内的靶向分布情况

参考文献

Ma Y, Zhao Y, Bejjanki N K, et al. Nanoclustered Cascaded Enzymes for Targeted Tumor Starvation and Deoxygenation-Activated Chemotherapy without Systemic Toxicity[J]. ACS nano, 2019, 13(8): 8890-8902.

光照诱导肿瘤能量代谢阻断

通过新型纳米颗粒的构建，利用肿瘤细胞高表达组织蛋白酶B的特性，设计酶剪切开关，将载有光敏剂的介孔纳米硅和和定位序列修饰的氧化钨颗粒偶联在一起形成行星-卫星结构。被肿瘤细胞摄取后纳米颗粒可以被高表达的组织蛋白酶B剪切，行星-卫星结构分开，配合不同波段的光照同时引发光动力和光热效应，切断肿瘤氧化磷酸化和糖酵解过程，阻断能量供应，YZ肿瘤的增殖。通过小动物活体光学成像进行肝部转移肿瘤的体内表征，实验结果表明这种纳米颗粒配合光照可以有效诱导肿瘤细胞产生“饥饿”环境，通过YZ肿瘤细胞能量供应清除体内的转移肿瘤。而正常细胞内组织蛋白酶B含量不足，行星-卫星结构无法分开，在光照过程中光动力产生的单线态氧可以进一步氧化纳米氧化钨颗粒，阻碍光热反应的发生，不会影响到正常组织的代谢过程，证实了可以基于能量代谢的肿瘤选择性jing准ZL策略的可行性。

图3 光照切断肿瘤细胞能量供应

参考文献

Huo D, Zhu J, Chen G, et al. Eradication of unresectable liver metastasis through induction of tumour specific energy depletion[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-17.

随着生活水平和YL卫生状况的不断提升，寄生虫感染在我们日常生活中似乎已日渐陌生。但在一些欠发达地区，由于贫困和不良的卫生习惯造成的寄生虫感染仍然威胁着无数生命。隐孢子虫作为一种常见的人畜共患寄生虫感染性疾病，是导致腹泻病的主要原因。由于其经由粪便传播，所以常经由水体污染而在卫生条件较差的地区发生群体性感染。感染通常是自限性的，健康的成年人在发生第 一阶段的较严重的腹泻之后便可恢复，但粪便仍可能具有传染性。新生儿或免疫力低下的如艾滋病患者或经免疫YZZL的病人在感染后病情较严重，是儿童早期死亡、营养不良和生长迟缓的重要原因，也是艾滋病人并发腹泻死亡的主要原因。

现今发现的隐孢子虫共有15个亚种，分别感染人、家禽、宠物、牲畜以及一些野生动物。由于不了解其致病机制，目前的ZL方案往往是对症用药而非对因用药。由于不同物种间感染模式差异，在实验动物(主要为牛等家畜)上应对隐孢子虫感染的有效疫苗往往对预防人的感染收效甚微。

针对以上问题，来自美国宾大兽医学院的研究人员发现了一种可用在小鼠模型中模拟与人患隐孢子虫病相似病症的隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri), 同时利用IVIS小动物活体成像系统帮助他们在体研究隐孢子虫的感染以及宿主经寄生虫或疫苗免疫激活后的抗感染现象。该研究于近期发表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。

要在小鼠体内模拟人患隐孢子虫病的合理模型，首先就需要找到相应的隐孢子虫。作者在农场收集了大量小家鼠粪便，经由测序，鉴定出一株与感染人的两种隐孢子虫(C. parvum和C. hominis)Z接近的一种鼠隐孢子虫(C. tyzzeri)。同时为了后续在体观察其感染模式以及宿主抗感染效果，作者通过CRISPR-Cas9技术将Luciferase基因和mCherry荧光蛋白导入到隐孢子虫的基因组中，构建了一株可以进行活体以及显微观察的隐孢子虫。

图一C. tyzzeri的鉴定以及基因编辑 (上：隐孢子虫种间基因组相似性比较，AB为常见感染人的两种隐孢子虫，C为常见感染鼠的隐孢子虫)

构建好的隐孢子虫就可以进行活体观察了，由于有活力的隐孢子虫可以表达Luciferase，在底物荧光素的作用下便可自发荧光，通过IVIS活体成像系统来实时监测体内隐孢子虫的繁殖情况。作者将这一光学观察方式与传统的粪便qPCR检测结果进行验证，二者具有很好的一致性。作者除了观察到这一新鉴定的隐孢子虫感染和人患隐孢子虫病的感染部位以及病理表征一致之外，还观察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隐孢子虫的危害，这一点与临床上免疫缺陷病人的高发病致死率也刚好吻合。

图二  C. tyzzeri感染模式观察

有了这一能够很好模拟人隐孢子虫感染的实验动物模型之后，便可以利用这一模型进行隐孢子虫的ZL以及疫苗的开发。由于临床上隐孢子虫高发地区人们在感染痊愈后再度感染的概率大大降低，因此作者首先检验了虫体是否可以直接作为疫苗来进行感染的预防。利用未经Luciferase标记的C. tyzzeri进行第 一次感染，同时实验组使用灭活的虫体作为疫苗进行第 一次免疫，在感染后用广谱抗虫药巴龙霉素杀灭后用Luc标记C. tyzzeri进行二次感染，能够观察到接触活虫的小鼠几乎不会发生二次感染，而使用灭活虫体作为疫苗无法激活体内免疫系统进行后续的抗感染作用。

图三 使用灭活的C. tyzzeri无法预防感染

因此作者想到可以使用减毒的活虫对宿主进行第 一次免疫。通过射线进行寄生虫减毒处理，可以降低其感染力至无害水平。在减毒活虫感染后30天，在使用Luc标记的C. tyzzeri进行感染，能够观察到该方法与野生型活虫二次感染模型有着相同的抗感染作用，说明减毒的疫苗是一种行之有效的预防隐孢子虫感染的方式。但是由于要调动自身免疫系统，这一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。

图四 使用减毒疫苗可以有效对隐孢子虫进行预防

虽然这篇文章也并未真正解决隐孢子虫的抗感染问题，但是构建出针对这一寄生虫病的实验小鼠模型已经为后续的科研工作者尝试更多ZL方案和预防措施提供了可操作可监控的实验工具。

参考文献

1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

      众所周知，多功能纳米载体可以有效识别肿瘤细胞并且在体外具有良好的抗肿瘤效果。但是目光转向体内，这些纳米载体往往在免疫系统的攻击下集体失灵。因为，人体免疫系统将会感知纳米载体的入侵，并且非常努力的把我们精心设计的载体清除掉。一旦纳米载体被清除掉，药物就很难到达目标肿瘤区域，很难实现杀伤肿瘤的效果。因此，纳米医学的一个非常重要的课题就是在不破坏免疫系统的前提下，让纳米载体躲避免疫系统的攻击。

      传统的解决方案我们都是通过在纳米载体表面携带各种伪装工具，尽量和免疫细胞捉迷藏，能躲则躲，绝不露面。但是这些载体也很容易迷路， 到达深层肿瘤部位的很少，并且在和免疫系统的斗智斗勇中，还会激发免疫系统产生新的抗体从而加速纳米载体的清除，因此很难达到ZL的效果。而随着仿生纳米医学的发展，科学家们可以让纳米载体穿上“吉利服”，不但可以在免疫系统中潜伏下来，还可以大摇大摆的从免疫细胞的眼皮底下蒙混过关，发挥极大功效。这种“吉利服”就是细胞膜提取物，不同种类细胞提取的细胞膜包覆在纳米载体表面还可以表现出特殊的功效，像红细胞膜或者一些免疫细胞膜可以提高纳米载体的体内循环时间，肿瘤细胞膜可以特异识别同源肿瘤等。穿上“细胞膜吉利服”之后，纳米载体将显现各方面的优势和潜力，从而成为近年来多功能纳米载体领域的研究热点之一。

1、T细胞膜包裹下仿生纳米药物的免疫识别增强

      通过糖代谢技术，获取嵌入叠氮基团（N3）的功能化T细胞，并提取功能化T细胞膜包裹在吲哚菁绿/聚合物纳米载体表面，构建仿生纳米光敏剂。功能化T细胞膜上不但原本的抗原受体可以赋予纳米光敏剂识别肿瘤细胞的能力，并且N3基团可以识别肿瘤细胞糖代谢靶点，从而实现纳米载体在肿瘤内部的富集，通过小动物光学成像可以清楚的看到T细胞膜包裹下仿生纳米药物在肿瘤部位的靶向作用，从而进一步实现肿瘤的jing准可视化ZL。

功能化T细胞膜仿生纳米颗粒实现特异性的肿瘤靶向和jing准光热ZL

参考文献：T Cell Membrane Mimicking Nanoparticles with Bioorthogonal Targeting and Immune Recognition for Enhanced Photothermal Therapy.  Advanced Science. 2019: 1900251.

2、生物学重编程全抗原细胞膜助力纳米疫苗的研发

      将肿瘤细胞和树突细胞融合细胞的生物学重编程细胞膜包覆在金属有机化合物表面，构建肿瘤疫苗可以在融合细胞膜表面表达大量免疫刺激分子，从而使得包裹融合细胞膜的纳米载体像抗原呈递细胞一样直接作用T细胞从而激活免疫反应。通过小动物光学成像，可以看到重编程细胞膜包覆的纳米载体在体内长循环到达肿瘤部位的过程。到达肿瘤部位的纳米载体还可以被树突细胞识别，从而诱导树突细胞成熟，增强免疫效果，Z终消除肿瘤，从而拓展肿瘤ZL平台。

生物学重编程细胞膜包裹纳米载体的过程以及肿瘤免疫的激活

参考文献： Cytomembrane nanovaccines show therapeutic effects by mimicking tumor cells and antigen presenting cells. Nature Communications. 2019, 10(1): 3199.

3、肿瘤细胞膜包裹的黑磷纳米载体拓宽光热肿瘤免疫ZL

      手术切除的肿瘤组织含有对患者特异性的新抗原，是成为制备个体化肿瘤疫苗Z好的材料来源。作者利用细胞膜封装的方式在二维光热黑磷量子点（BPQDs）表面包裹肿瘤组织的细胞膜，从而制备具有光热效应的纳米肿瘤疫苗(BPQD-CCNVs)，并且把纳米肿瘤疫苗和集落刺激因子（GM-CSF）装入热敏水凝胶中。皮下注射水凝胶后可以在红外光的作用下持续释放纳米疫苗以及集落刺激因子，招募并激活DC细胞，从而捕获肿瘤抗原并激活肿瘤特异性T细胞。同时，尾静脉注射PD-1YZ剂，阻断PD-1/PD-L1免疫检查点通路，增强T细胞抗肿瘤免疫应答效应。通过活体光学成像我们可以对肿瘤进行生物发光标记，从而长期连续监测肿瘤在体内的发展情况。实验结果表明通过光热免疫ZL可以有效清除实体肿瘤同时YZ术后转移的复发。

(A)光热肿瘤免疫实验设计思路；

(B)FITC标记的水凝胶在体内的降解情况；

(C)个性化光热肿瘤免疫ZL可以有效YZ术后实体肿瘤的复发；

(D)个性化光热肿瘤免疫ZL可以有效YZ术后肿瘤的转移。

参考文献：Surgical Tumor-Derived Personalized Photothermal Vaccine Formulation for Cancer Immunotherapy. ACS nano. 2019, 13(3): 2956-2968.

珀金埃尔默拥有先进的分子影像技术，其小动物活体成像系统为生物医学的各种研究领域（包括肿瘤、干细胞、传染病、炎症、免疫性疾病、神经疾病、心血管疾病、代谢疾病、基因ZL、纳米材料、新药研发、植物学等）提供了完整的成像解决方案。

复制查看下面链接，获取相关产品及应用资料：

https://account.custouch.com/perkinelmer/site/#/list/15?_wxr_1564535099232&refresh=true

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

4月20日上午，徕卡与转化医学网共同举办了网络研讨会——“抽丝剥茧，超多重免疫标记解密肿瘤微环境之奥秘”。徕卡生命科学部的高级应用专员刘继红和Cell DIVE应用科学家Michael Smith为广大观众揭示了CELL DIVE 超多重标记解决方案如何轻松应对复杂的肿瘤微环境，为临床肿瘤的研究和治 疗提供了优秀的研究工具。Indica Labs应用科学家赵永田重 点介绍了在HALO中对获取的Cell DIVE图像的处理、分析步骤以及如何进行高纬的空间生物学分析，用以了解肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用关系对研究肿瘤免疫应答的作用机制。

01

CELL DIVE使用的抗体是开放的吗？有大约多少种经过验证的抗体？

A：CELL DIVE 的抗体是开放的，有350种以上的抗体经过验证的抗体可以使用。

02

CELL DIVE可以在临床上用吗，是否有注册证？

A：目前没有注册证，正在申请中。

03

这个平台的检测联系哪位呢？

A：可以联系Leica公司各地的应用支持和销售。

04

这个染色是仪器自动染色吗？

A：可以手动染色也可以和自动染色仪联用自动染色。

05

哪个实验室可以检测？

A：Leica公司有DEMO机，可以提供一定的演示。

06

成像是全片还是一个视野？

A：成像仪可以选择全片成像或者选取一个或多个视野成像。

07

怎样避免非特异性染色 ？核阳性的和胞浆包膜可以随意搭配吗？

A：首先要选择特异性好的抗体，我们抗体库的抗体都是经过验证的抗体。

细胞核阳性和胞浆包膜理论上可以自由搭配。

08

每一轮染完了，除了染料失活，是不是还需要去除一抗？

A：每一轮染色成像完成，染料失活 不需要去除一抗。

09

CELL DIVE是不需要摸索一抗浓度的吗，固定的protocol会不会造成有的组织染不出来有的组织却染色过强？

A：徕卡的protocol适用于绝大多数的组织，有些组织的某个marker 表达特别高或者特别低，可能需要修改抗体浓度。

10

抗体是什么方法学检测标记？除了主讲人介绍的荧光滤镜，能否使用其他的荧光标记和滤镜？

A：抗体验证时参照同样marker的免疫组化的结果；为了减少串色的发生，我们推荐使用Cy2、Cy3、Cy5、Cy7光谱基本相同的染料标记。

11

成像也是设备自动化进行的吗？

A：成像时设备自动进行的，但是可以在拍照前根据样本的染色情况进行优化。

12

Did you find any nonspecific staining while utilizing the different CD markers for immune cells?（Michael Smith）

A：The Cell DIVE solution comes with a list of 350+ antibodies that have been validated for use with the workflow, and for specificity and sensitivity. For antibodies that are not used from the list, we provide details on a three part antibody validation process that also ensures that antibodies used are specific. In the case of residual nonspecific signal, this is likely removed by the autoflourescence imaging and removal of that signal that occurs at every round. So, in our hands, nonspecific staining is minimized at the level of antibody quality control and the image processing that the software performs.

13

关于细胞间邻近距离的分析，我们如何设定所计算的距离范围？

A：关于细胞间邻近距离的分析，所定义距离的范围目前还没有相应的标准。考虑到不同细胞亚型的相互作用，不同免疫细胞亚群之间邻近距离的设定可能需要不同的标准。在分析中，HALO可以对距离进行设定，并按照不同的区间（例如0~5μm，5~10μm，10~15μm……）给出邻近细胞的数量和密度。分析中先进行预分析，根据不同距离范围内免疫细胞的密度和临床信息进行相关性分析。再把确定的距离应用到所用的样本切片中。

14

在分析过程中，我们可以选择局部视野进行分析吗？还是仅能对全组织切片进行分析？

A：分析中，我们建议针对全景组织切片进行分析，但HALO也可以定义ROI区域进行选择性的视野进行分析。这两种分析方法在HALO里都可以实现的。

癌症仍然是威胁人类健康Zda的敌人之一，虽然目前针对癌症的ZL方案有了很大的发展，但是癌症治愈难并且ZL费用高的现状仍然不会在短时间内得到改善。因此，除了在ZL阶段应对癌症外，早期的诊断检出仍然是降低肿瘤死亡率的重要手段。

除常规筛查外，内源性肿瘤标志物的检测成为当前发展的新兴技术，其中包括CTC，ctDNA以及肿瘤外泌体等的检测。内源性标志物检测的难点在于体内标志物会快速清除且检测背景高以及体内无法富集都是导致它们应用难以推广的重要原因。

为解决这个难题，美国斯坦福大学医学院的San极v Gambhir博士团队对免疫细胞中的巨噬细胞进行改造，成功在小鼠肿瘤模型中实现肿瘤细胞的早期检测和跟踪标记。

其主要策略是：通过对巨噬细胞进行改造，在肿瘤诱导产生的M2型巨噬细胞的启动子后面标记上生物发光的标记。当在肿瘤环境中，可以更加诱导巨噬细胞向M2型分化，并启动荧光素酶基因的表达。利用该策略可以检测出转移瘤以及皮下瘤的发生。

目前，这项技术可用于检测直径小至4毫米大小的肿瘤，不仅更加优于常规肿瘤体积检测，而且与常见生物标志物检测相比，如体外RLU方案，CEA指标检测方案 ，ctDNA，qtPCR方案等检测，表现出更高的灵敏度。

参考文献

San极v S. Gambhir et al. Engineered immune cells as highly sensitive cancer diagnostics. Nature Biotechnology (2019).

      2018年以来，肿瘤免疫研究进一步突破。本文将围绕陈列平教授的三篇ding级论文，揭示新一代肿瘤免疫疗法。

1、免疫正常化

      2018年10月，陈列平教授团队在《Cell》杂志上发表了A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization关于“免疫正常化”的综述文章，肿瘤免疫正常化（Normalizing tumor immunity），在理念上改变了我们对肿瘤免疫的认识，文章指出抗PDZL（这里包括所有目标在于阻断这个通路的所有方法），在原理上并不是增强免疫反应，而是把病人自身应该有的，但在肿瘤生长中被弱化的反应带回到常态。

      文章中将免疫反应过程比作一条有流水的通道。在这个过程中，正常的免疫反应就是通道中正常通畅的水流。如果通道堵塞，水流受到影响，通道将无法充分排水。在这种情况下，“增强”策略可以解释为增加通道的压力，以克服排水不足，但如果通道内压力增加太多，就会有破坏通道的风险。反之，“正常化”策略则会通过识别并解除阻塞以恢复正常水流，避免危及通道管壁。

图1  免疫增强与免疫正常化

2、LAG-3-FGL1通路的作用

      同年12月，陈列平教授团队再次在《Cell》上发表了题为Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3的论文，证明了纤维介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1, FGL1)是LAG-3的一个重要的功能性配体，并揭示了该LAG-3-FGL1通路在肿瘤免疫中的作用。

      淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)是一种主要存在于活化T细胞上的转基因膜蛋白，其主要作用是作为一种表达YZ信号的受体。纤维蛋白原样蛋白1 (FGL1)是一种肝脏分泌的蛋白质，可以YZ抗原特异性T细胞活化。

图2  FGL1作为LAG-3的功能性配体可以YZT细胞活化

      FGL1-LAG-3相互作用是独立于B7-H1-PD-1通路的另一条肿瘤免疫逃逸通路，阻断这条通路能和抗PD-1ZL起到协同作用。

      总之，本研究发现并证明了FGL1-LAG-3是肿瘤免疫逃逸的一条新通路，且可作为肿瘤免疫ZL的潜在靶点。

3、肿瘤ZL的靶点

      2019年3月，陈列平教授团队在Nature Medicine上发表题为Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy的论文，鉴定并证明了Siglec-15是一种免疫YZ分子，可作为正常化免疫ZL的潜在靶点。

图3  TCAA筛选结果示意图

      Siglec-15是一个唾液酸结合型免疫球蛋白样凝集素家族基因，编码一个非常短的胞外结构域，该结构域包含一个免疫球蛋白可变区和一个2型恒定区。 

      该团队通过一个高通量功能筛选系统（Genome-scale T cell activity array, TCAA）鉴定了该分子。Siglec-15除了在健康的骨 髓细胞中表达外，在多种人类肿瘤细胞和肿瘤侵犯的骨 髓细胞中广泛高表达，且其表达是与B7-H1互斥的。

      Siglec-15在多种正常的免疫细胞中不表达或低表达，但在巨噬细胞中可见表达，且能被巨噬细胞集落刺激因子所诱导，是一种巨噬细胞相关的免疫YZ分子，同时Siglec-15又能为IFN-γ所调节，这可能是它与B7-H1表达互相排斥的部分原因。重要的是Siglec-15能在体内外YZ抗原特异性T细胞的活性。

      动物实验发现，基因敲除或抗体封闭Siglec-15后的转基因小鼠模型所荷载的移植瘤生长明显受YZ，肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应明显增强。Siglec-15特异性的单抗α-S15单独使用即有抗肿瘤作用，当与anti-PD-L1联合时效果明显增加。Anti-Siglec-15与已有的ZL手段相比，具有一些明显的优势，比如Siglec-15在正常组织上表达极少，正常组织可能不会受到Anti-Siglec-15疗法的影响，安全性预期良好。同时肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞可见表达，具有较高的选择性，甚至可能成为肿瘤微环境选择性ZL的靶点。

写在结尾的话：

      在陈列平教授团队的两篇研究论文中,均使用到PerkinElmer的放射性试剂和检测仪器对T细胞的功能进行研究, PerkinElmer为人类健康贡献自己的力量。如果您对我们的解决方案感兴趣可以留言给我们。

复制下面链接查看了解珀金埃尔默放射性检测仪器及应用：

https://account.custouch.com/perkinelmer/site/#/list/15?_wxr_1563501888979&refresh=true

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn