使用ACE方法开发工具包(MDKs)进行色谱柱筛选

方法开发的四个简化步骤
• ACE MDKs包括了为互补选择性而精心设计的3支色谱柱。
• 色谱柱筛选是一种简单而又功能强大的方法, 可以快速识别Z合适的色谱柱。
• 通过筛选2种不同的流动相有机改性剂可以使方法更全面。
• 以下的流程图总结了如何通过4个简单步骤执行方法开发筛选。

开始

diyi步：选择流动相pH和缓冲液
根据分析物性质 (即pKa, logP和logD数据) 进行选择。对于未知分析物，使用酸性流动相作为起点。

第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色谱柱)
梯度扫描以MeOH和MeCN作为有机溶剂,进行5-95％梯度筛选。

第三步：查看数据

选择Z佳色谱柱和有机改性剂。

第四步：方法优化

如有必要, 检查温度, pH值, 梯度斜率,梯度范围等。

是否实现分离？

是-方法开发完成

否-改变流动相条件（pH值,缓冲液等），回到第二步继续实验。

选择色谱柱和粒径尺寸。
由LC系统和用户的偏好决定。对于400 bar的HPLC系统来说, 5μm 150 x 4.6mm是个不错的选择。
对于600 bar优化的HPLC系统, 可使用2 和3μm粒径的较短色谱柱 (如100mm)。1.7μm粒径的短柱 (如50mm)适用于UHPLC系统。

如何确定合适的筛选梯度时间？
梯度时间可以使用公式1计算。
VM可用公式2计算。

请务必记住在下一次注射前, 在梯度洗脱后以至少10倍VM (柱内体积) 进行一次等度重新平衡。

为何使用色谱柱筛选？

• 改变色谱柱的固定相可能对选择性造成显著影响 (图1)。
• 在相同的流动相条件下, 筛选不同的色谱柱可以帮助您以更高的分辨率更快地实现所需的分离。

图1：改变色谱柱固定相的影响。
色谱柱：50x2.1mm

流动相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)

梯度：5分钟内3-B，
流速：0.06mL/min

温度：40°C

检测：UV，254nm

样品：1）甲硝唑，2）苄醇，3）氢氯噻嗪，4）香草醛，5）羟苯甲酯，6）1,2-二硝基苯

• ACE MDKs将具有不同相互作用机制的色谱柱组合在一起, 以Z大限度地提高选择性并增加分离具有挑战性的混合物的可能性。
• 性价比高, ACE MDKs与单支色谱柱价格相同！
• 两种Z受欢迎的ACE反相 (RP) MDK (参见下表) 包括了为利用不同的保留机制和Z大化选择性而独特设计的相。
• 所有六个相都可以在反相 (RP) 条件下使用, 并且具有与C18一样的稳定性。

1近似值– 通过半定量机制加权和/或通过参考使用>100特征分析物的其他ACE相来确定。

• 其他的ACE方法包还有HILIC分析包, 生物大分子300Å分析包和实心核(UltraCore) 分析包
• 同样提供微孔柱尺寸 (内径0.5和1.0mm)。

成功范例
对乙酰氨基酚及有关物质

ACE反相系统性方法开发方案

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下期CATO直播间再会！

表2：

ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处

增加PH范围
大多数生物分子是带电荷的。

肽类和蛋白质带有多种电荷。从小分子的经验来看，已流动相pH可以成为改变保留值并因此而优化带电化合物分离度的有力工具。

肽类也是如此。

再次以使用血管紧张素II和III作为实例，下图显示在pH=2的条件下，ACE超惰性色谱柱或填充有更具活性固定相的色谱柱上这两种肽未实现分离。

通过将pH增加至7，这两种色谱柱则均能提供良好的分离度。

然而，尽管ACE超惰性色谱柱保持了良好的峰形，但填充低纯度硅胶的色谱柱显示其峰形较差和性能损失。

在极性化合物的许多反相应用中观察到了这种现象。

在中等pH值时，硅醇相互作用更为普遍，因此峰拖尾在活性固定相上变得更加明显。

流动相pH对分离度的影响

色谱柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300Å
流动相：

pH 2 A：0.1% TFA（溶于水中） B: 0.1% TFA（溶于乙腈中）
pH 7 A: 10mM NH4OAc（溶于水中） B: 乙腈 15分钟内25%-40% B
流速：1.0 mL/min

检测：UV 215nm
化合物：

1.血管紧张素II
2.血管紧张素III
3.血管紧张素I

调节流动相的pH是提高选择性的有力工具。只有基于超纯硅胶的色谱柱才能在更高的pH值下保持性能。

备注：比较性分离物不代表所有应用。

ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处
提高灵敏度
将TFA（三氟乙酸）用作肽类和蛋白质反相分离的流动相添加剂。
该添加剂通常被用于改善肽类和蛋白质复杂混合物的峰形和分离度。

如下图所示，在流动相中使用0.1％TFA可以使填充有活性固定相的色谱柱产生与由超惰性固定相制备的新一代色谱柱相当的峰宽。

然而，随着TFA浓度降低至0.01％以及Z终的0.005％，超惰性相上的峰宽保持不变，但活性固定相上的峰宽会发生变形。
使用极低水平TFA分析肽类和蛋白质的能力有利于采用质谱法进行高灵敏度检测。

TFA可与多肽形成复合物合并增强选择性。然而，该相同的复合作用会降低质谱仪的灵敏度。

用于肽类和蛋白质分析的ACE 300Å色谱柱

蛋白质
条件
色谱柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
温度：环境
流动相：A. 0.1% TFA（溶于水中） B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），30分钟内 5%-70% B
检测：UV, 280nm

化合物
1. 核糖核酸酶A
2. 细胞色素C
3. 全铁转铁蛋白
4. 脱辅基肌红蛋白

肽类

条件
色谱柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
温度：环境
流动相：A. 0.1% TFA（溶于水中）B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），25分钟内10%-40% B
检测：UV, 220nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催产素
3. 血管紧张素II
4. 神经降压素

灵敏度和峰形，随TFA的浓度而变化

色谱柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300Å
流动相：A：TFA（溶于水中） B： 溶于乙腈中的TFA（按照上述说明为％TFA），37.5分钟内10％-55％B。
流速：1.5mL/min
检测：UV 200nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催产素
3. 血管紧张素II
4. 神经降压素

随着TFA浓度的降低，低纯度硅胶色谱柱（右图）显示性能急剧下降。
由超惰性硅胶制成的色谱柱（如ACE）会在TFA浓度降低时保持性能。

备注：比较性分离物不代表所有应用。

ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处

优化选择性
TFA和其他流动相添加剂与肽类和蛋白质的复合能力可用于调节选择性并改善分离度。如下图所示，将TFA浓度从0.1％降低至0.01％可使血管紧张素II和III实现分离。

在超惰性ACE色谱柱的情况下，随着分离度的显著改善，峰形和灵敏度保持恒定。在Vydac色谱柱（填充有更具活性的固定相）的情况下，峰形被严重破坏。

选择性，随TFA的浓度而变化

色谱柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300Å
流动相：A：TFA（溶于水中）B: 80％TFA（溶于乙腈中），20％TFA（溶于水中），（按照上述说明为％TFA），15分钟内25％-40％B
流速：1.0 mL/min

检测：UV 215nm
化合物：

1.血管紧张素II
2.血管紧张素III
3.血管紧张素I

通过降低TFA浓度来改善分离度。由低品质硅胶制成的色谱柱显示其性能降低。

备注：比较性分离物不代表所有应用。

所有的ACE公司的UHPLC/HPLC固定相都是基于超惰性硅胶的特殊键合与封尾，以此Z小化的二级反应从而获得了优异的峰形
ACE的色谱柱采用了两种柱管:

• ACE的色谱产品有采用HPLC级柱管填装的，这种柱管的Z大耐压是275bar，它适合3um与5um的色谱产品，所有的产品货号是以“ACE-”开头；

• ACE的产品也有采用HPLC/UHPLC兼容柱管填装的，这种柱管的耐压上限是1000bar。它适合于1.7um,2um,3um以及5um等合种粒径的产品，所有的产品是以货号“EXL-”。
  两种柱管的设计都确保了填料的低分散性以及稳定性以获得高柱效

对于同样的3um,5um填料填装于两种柱管时，都给以相同的柱效
例如一支ACE C18 150 x 4.6mm, 5um(货号：ACE-121-1546) 色谱柱相比于一支ACEExcel 150 x 4.6mm, 5um C18(货号：EXL-121-1546U) 色谱柱，将获得同样的选择性与保留行为(对于固定相一样的两种柱管填装柱都有是一样的置换）

ACE C18, 150 x 4.6mm, 5um

每种5支: ACE C18 和ACE Excel C18
所有柱都采用同批次填料
Mean (n=5) Peak 4 Mean (n=5) Peak 4

的重现性基于柱柱间以及两种柱管之间

ACE的1.7um与2um的色谱产品只能采用兼容的UHPLC/HPLC柱管基于背压的需要，所有货号以“EXL-开头”
ACE的UHPLC/HPLC兼容的高压柱管所填装的产品（货号EXL-开头）可以完全取代HPLC柱管填装的同等固定相产品（货号ACE-开头）。不改变分离与保留行为。
同时对于3u的小粒径产品，因为压力原因，“EXL-”置换“ACE-”更有利于获得更长的寿命。

直流是依靠直流电源运行的电动机。有刷直流电动机通过内部换向，固定的永磁体和旋转的电磁铁直接从供应给电动机的直流电中产生扭矩。无刷直流电机具有启动成本低，可靠性高，调速简单，寿命长的优点。缺点包括高维护和高维护。同步直流电动机（例如无刷直流电机和步进电机）需要外部换向以产生转矩。无刷直流电机使用转子中的旋转永磁体，电机外壳上的固定电磁铁以及将直流电转换为交流电的电机控制器。

直流电机的设计和定制得益于专业的电机制造解决方案设计团队。机械工程师直接与客户合作，紧密满足客户的应用需求，以便客户最终将获得符合应用程序的电机制造设计解决方案，并限度地提高定制电机的性能。当电机的性能要求越高，对其生产的设备也会有相对应的要求。广州昊诚电机专注于非标定制电机整套智能驱动方案。对电机的性能及工艺要求都有一定的行业经验。可提供完善的整套智能驱动方案及可行性建议给到电机厂商客户。

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电机作为机械运动的“大心脏”，无时无刻出现在我们生活中，随着工业的快速发展，电机在各行各业的匹配就显得尤其重要，即要求电机高精度、微型化、低速化。

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Q:定制电机自动化设备。需要提供哪些东西？

需要电机的成品图、零件图、工艺流程、工艺要求及电机图纸

Q:设备做好了，但是不符合我的要求怎么办？

根据我们的技术协议来做，如没有做到可按照技术协议条款负责。

综上所述，直流无刷电机如果没有合适的规格参数，可以根据实际。

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菲罗门与ACE色谱柱的保养方法

色谱柱是一种消耗品，因此使用寿命有限。

对于大多数应用，色谱柱应持续进行500-2000次注射（进样），但这会因样品的清洁度、流动相的pH值和保护柱卡套的使用（是否使用保护柱）而不同。

这里列出的做法有助于Z大限度地提高硅基（硅胶基质）色谱柱的使用寿命。

一、色谱柱的平衡：当从一个流动相更换为另一个流动相时，或者在回收梯度（梯度循环）时，应需要10-20个柱体积。

下表显示了各种色谱柱尺寸（规格）的色谱柱体积。

如果溶剂的变化不太剧烈（例如80％至20％的ACN/水与ACN至THF（与之相对的由ACN至THF）），则需要的体积较少。

检查平衡Z简单方法是进行两次样品注射。

如果保留相同，则色谱柱充分平衡；如果保留变化，应增加平衡体积并重新试验。平衡与溶剂的体积有关，与时间无关。

所以较高的流量（流速）可以减少平衡时间。

                                        近似的色谱柱容量（mL）

二、色谱柱冲洗是一个简单的过程，可以通过清洗色谱柱中的顽固（保留较强的）物质来延长色谱柱的寿命。

每天结束色谱柱的使用时，应除去一切缓冲液（应除去色谱柱中的缓冲盐），然后用100％强溶剂（通常为ACN或MeOH，采用反相方法）冲洗色谱柱。

下一页列出的详细冲洗程序可以有效恢复色谱柱的性能，但应牢记：色谱柱是一种消耗品，因此请勿期望它能够永远的持续使用！

避免用100％的水冲洗反相色谱柱（嵌入极性基团或“AQ”色谱柱除外），因为相（固定相）去湿会影响清洗效果，而且流动相色谱柱的重新平衡会非常缓慢。

对于您的色谱柱，请按照以下所述的一般步骤，使用特定溶剂进行色谱柱冲洗。

应在冲洗之前查看制造商的建议（生产商说明书），以免损坏色谱柱。
1. 拆掉并翻转色谱柱（拆下色谱并反接）
2. 将色谱柱连接到泵上，而非检测器（不接检测器）
3. 用10-20个柱体积的溶剂进行冲洗，且流速不得高于QC色谱图的流速
4. 如果改变以下步骤，应确保在每个连续步骤中使用可混溶溶剂（溶剂可互溶）

反相色谱柱（C18，C8，C4，苯基，CN，'AQ'型）
a. 流动相无缓冲液
b. MeOH或ACN

如果金属离子被认为是污染的致因，应使用0.05M EDTA水溶液冲洗，然后用水冲洗，并按上述顺序冲洗。使用离子对试剂的色谱柱应专门用于离子对的应用之中。

未键合的硅胶柱（SIL）
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

键合正相柱（CN、NH 2、二醇）
a. 三氯jia烷
b. IPA
c. 二氯jia烷
d. 己烷

阴离子交换柱（SAX，WAX）
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯jia烷
d. 甲醇
e. 水

阳离子交换柱（SCX，WCX）
a. 水（冲洗时注入4x200L的DMSO）
b. THF

蛋白质的体积排阻柱
对于弱保留的蛋白质
a. 0.1M磷酸盐缓冲液，pH为3
对于强保留的蛋白质
a. 100％水至100％ACN的梯度，运行60分钟

三、色谱柱的合理存放有助于延长柱的使用寿命。

Z简单的存放步骤为：从柱中除去一切缓冲液，然后用10-20个柱体积的强流动相溶剂（例如用于反相的MeOH或ACN）清洗柱，以除去柱中的顽固（强保留）物质。

然后用制造商指定的存储流动相，以10-20个柱体积的容量冲洗色谱柱（该信息应随色谱柱提供，并在QC检测色谱图中进行详细的说明）。

Z后，安全地盖上柱帽（拧紧堵头），以防流动相蒸发。
除了色谱柱制造商明确建议的特定情况（例如一些离子交换柱）外，请勿使用缓冲液或者少于约25％的有机溶剂来用于储色谱柱存储，因为它们会导致微生物的滋生。（保存色谱柱，以防微生物的滋生）

色谱柱ACE

近年来USP和ICH都针对分析方法开发与验证进行了修订。USP新收录通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，分别从分析方法开发、分析方法性能确认及分析方法使用三个阶段分别阐述如何在分析方法整个生命周期内对方法进行管理。而ICH Q14分析方法开发和Q2(R2) 分析方法验证的修订也进入到了第三阶段，按照计划其将在2023年5月前完成阶段的定稿。这些信息都表明了分析方法开发和验证的管理将会变得更严谨、更科学。

因为色谱仪器包括色谱-质谱联用技术在药物开发过程中的广泛使用，色谱分析方法的开发与验证也成为了方法开发与验证，乃至分析方法生命周期管理中的重要内容。针对色谱方法开发与验证的整体流程，可以将其大致分为：方法筛选、方法优化、耐用性测试和完整的方法验证这四个阶段。

而这四个阶段都离不开仪器准备、队列运行、数据查看与处理以及报告这几个环节。赛默飞的旗舰版色谱数据系统Chromeleon 软件功能丰富而注重实践，能够帮助实验室的色谱分析实现精简、高效的工作流，以实现更快的样品到结果的转换。

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在Chromeleon CDS 中创建队列时可以通过手工填写的传统方式，也可基于事先建好的队列模板。值得一提的是Chromeleon 强大的样品列表功能。除了运行样品的基本信息（样品名称、仪器方法、运行的其他必须参数）之外，还可以通过自定义变量的形式，添加额外的注释信息，例如色谱柱类型、缓冲液名称等用于清晰识别每一针进样的信息。

使用者还可以进一步创建一些自定义变量并将其与仪器方法中的参数进行链接，更加简单地实现实验设计（DoE）的环节。一旦基本方法固定，便可通过改变色谱柱选择阀或溶剂选择阀等参数实现不同要素的组合以寻找具备可行性的色谱条件，也体现了ICH和USP所倡导的“多变量分析方法开发”这一方针。相比传统的样品队列创建方式，减少了所需创建的仪器方法的数量，并以清晰直观的模式展示了所使用的变量以及变量值，结合缩略图功能提供了更直观的信息。

在数据处理阶段，可以再次利用Chromeleon 样品列表中的自定义结果变量功能，可以方便地实现运行样品的同时进行结果计算，例如系统适用性参数的计算，峰面积、含量以及测试是否通过等信息的显示，帮助使用者快速查看所需信息以便灵活调整实验的方向。

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Chromeleon

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ICH指南定义了方法验证应该执行包括专属性、准确度、精密度、检测和定量限度、线性、范围和耐用性的测试。除了样品运行的环节之外，计算、整理和报告验证结果也可能需要很长的时间，而且大多数测试都涉及将结果与指标进行比较，相对比较繁琐。 

在eWorkflow的基础上，Chromeleon 又提供了一个方法验证的高效工具，ICH方法验证扩展包。扩展包内有一系列的模板，每个模板都包含处理方法、报告模板和自定义变量以覆盖所需的变量和参数。所有这些都在 eWorkflow 程序中捆绑在一起，以确保正确执行ICH所要求的相关测试，减少人为错误并加速流程：eWorkflow 可以引导创建队列，自动执行所有计算，并通过报告直接显示通过或失败的结论。

以上介绍的几个工具仅为Chromeleon 强大功能的冰山一角。结合Chromeleon 实用的多厂商仪器控制能力，出色的系统适用性和智能运行控制功能，便捷的数据积分、处理功能，直观的图形化显示，全面的合规能力，Chromeleon不但可以提升方法开发、验证的效率，也一定能够帮助色谱工作者执行分析方法生命周期的管理。