怎么分离和鉴定土壤中的固氮微生物？

一、接种
1．接种前,将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿,放在37℃的恒温箱中一两天.随后,选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用.
2．取10g土壤,放在无菌研钵中,注入5mL无菌水,并用无菌玻璃棒搅拌均匀,备用.
3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌.略微打开培养皿盖,将接种环放在培养基边缘处冷却.然后,用接种环蘸取少许稀泥浆,轻轻地点接在培养基的表面上,共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰,以免烧伤).
4．接种后,轻轻地盖上培养皿盖,将培养皿放在实验桌上,并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期.
二、培养
将接过种的培养皿放入恒温箱内,在28～30℃的温度下培养3～4d.
三、观察
4d后,取出培养皿,仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液.黏液初为无色透明,以后为乳白色,Z后变成褐色,表明含有自生固氮菌.
四、镜检
1．制作临时涂片
(1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片,将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤,以便除去上面的酒精.将载玻片放在实验桌上,待载玻片冷却后,在载玻片的ZY滴一滴无菌水.
(2)在火焰旁,按照接种的要求,用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液,将黏液涂在载玻片上的水滴中,加1滴结晶紫染液,混合均匀,染色1min.
(3)另取一片载玻片作推片.将推片自液滴左侧向右侧移动,使液滴均匀地附着在两片之间.然后,将推片自右向左平稳地推移(两片之间呈30～45°夹角),推出一层均匀的菌膜.
2．干燥
让临时涂片自然干燥(自生固氮菌的临时涂片不用加热固定,以免破坏荚膜).
3．在显微镜下观察
依次通过低倍镜和高倍镜观察临时涂片,可以看到染成紫色的自生固氮菌.