什么是初均速法?

银黄微型灌肠剂主要由黄芩(Scutellavia baicalensic Georgi)和金银花(Lonicera japonica Thunb)等药组成，具有清热、、XY等功效。其主要成分黄芩甙(baicalin)和绿原酸(chlorogenic acid)均具邻二酚羟基，久置会氧化降解〔1〕，温度可加速这一变化过程。本文以绿原酸和黄芩甙含量为指标，根据初均速法原理〔2〕，对该制剂进行加速破坏实验，用GX液相色谱法测定其含量的变化，建立直线回归方程，从而求出r值及室温有效期和活化能。

1 实验仪器与材料
1.1 仪器
LC-8AGX液相色谱仪(日本岛津)，SPD-6AV可见紫外检测器，SCL-8A系统控制器，C-R4A数据处理机，LG15-W型高速离心机(北京医用离心机厂)，UV-160A紫外可见分光光度计(日本岛津)，电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)。
1.2 材料
银黄微型灌肠剂(自制，批号为970201)，绿原酸与黄芩甙对照品(ZG药品生物制品检定所，批号分别为753-8701与715-8501)，甲醇(优级纯)，水(去离子重蒸水)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 GX液相色谱法测定绿原酸与黄芩甙的含量
2.1.1 对照品溶液的制备
绿原酸对照品溶液的制备:称取绿原酸对照品4.3 mg，用20％乙腈溶解并定容至25 mL，即得。
黄芩甙对照品溶液的制备：称取黄芩甙对照品9.9 mg，用50％甲醇溶液溶解并定容至25 mL，即得。
2.1.2 供试品的制备
吸取样品1 mL于10 mL容量瓶中，加20％乙腈稀释至刻度，再吸取0.025 mL于10 mL容量瓶中，加20％乙腈 稀释至刻度，高速离心 (15 000 r/min，15 min)待用。
2.1.3 检测波长的确定
取绿原酸对照溶液，以20％乙腈溶液为空白进行紫外扫描；取黄芩甙对照品溶液，以50％甲醇溶液为空白，进行紫外扫描，谱图见图1。绿原酸的Z大吸收波长λmax为326 nm，黄芩甙的Z大吸收波长λmax为280 nm。
2.1.4 色谱条件
绿原酸的色谱条件：Shim-pack CLC-ODS柱(15 cm×6.0 mm);柱温：室温;检测波长：326 nm;流动相：甲醇－水－冰醋酸(22∶78∶1);流速：1 mL/min;纸速：2.5 mm/min;灵敏度：0.02AUFS。
黄芩甙的色谱条件：Shim-pack CLC-ODS柱(15 cm×6.0 mm)，柱温：室温;检测波长：280 nm;流动相：甲醇－水－磷酸－三乙胺(60∶40∶0.2∶2 滴);流速：1 mL/min;纸速：10 mm/min;灵敏度：0.02 AUFS。

图1 黄芩甙与绿原酸的紫外吸收谱图
Fig.1 Baicalin and chlorgenic acid UV spectrum
——:黄芩甙Baicalin；……:绿原酸Chlorgenic acid.

图2 黄芩甙与绿原酸对照品色谱图
Fig.2 Baicalin and chlorgenic acid collator chromatogram
a:绿原酸Baicalin; b:黄芩甙Chlorgenic acid.

图3 样品色谱图
Fig.3 Sample chromatogram
a:绿原酸Baicalin;b:黄芩甙Chlorgenic acid.

2.1.5 标准曲线的制备
2.1.5.1 绿原酸标准曲线的制备
分别取绿原酸对照品溶液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL于10 mL容量瓶中，加20％乙腈至刻度，高速离心(15 000 r/min，15 min)，按上述色谱条件进样，进样量20 μL，色谱图见图2，以进样量为x轴，峰面积为y轴，绘制标准曲线。其回归方程为y＝188 186.046 5x－1 914， r＝0.999 9，表明绿原酸对照品在0.086 μg～0.43 μg范围内具有良好的线性关系。
2.1.5.2 黄芩甙标准曲线的制备
分别取黄芩甙对照品溶液0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.07 mL、0.09 mL，各用50％甲醇溶液稀释至1 mL，在上述色谱条件下，各以15 μL进样测定峰面积，色谱图见图2；以进样量为x轴，峰面积为y轴，绘制标准曲线。其回归方程为y＝2 413.075＋2.041 028×105x，相关系数r＝0.999 7。表明黄芩甙对照品在0.059 μg～0.53 μg范围内具有良好的线性关系。
2.2 初均速加速破坏法实验
2.2.1 方法〔2〕
取银黄微型灌肠剂4支(每组)，置电热鼓风干燥箱内经下述不同温度及时间进行恒温加速破坏实验(见表1)，到时间后立即取出用冷水冷却至室温，终止反应。分别将每组的样品打碎混匀，用HPLC测其绿原酸与黄芩甙含量。
2.2.2 测定结果
数据处理的数学模型为以绿原酸和黄芩甙的初始浓度为Coj，将在不同温度(Ti)和相对应时间(ti)时所测浓度分别转换成残存率(表1)；色谱图见图3。按下式计算不同温度下的初速度〔2〕

Voj＝(Coj－Cij)/ti

式中Coi、Cij分别为绿原酸和黄芩甙在室温下与不同实验温度下的浓度；ti是与温度相对应的恒温时间(h)。〔j＝1(绿原酸)、2(黄芩甙)；i＝1，2，3，…，m〕
以lgvoj对1/T回归，得直线回归方程lgvoj＝a＋b/Ti和直线相关系数r，再根据Arrhinius公式lgvoj＝〔－E/(2.303×RTi)〕＋lgA，式中R为气体常数，R＝1.987卡.度-1.克分子-1求出活化能E。
由直线回归方程求出室温(298 K)下的lgv298K，由反对数求得v298K。
由Voj＝(Coj-Cij)/ti求出室温贮存期，即计算T＝298 K时100％-C％＝10％时的时间t，得。
绿原酸数据处理结果：lgvo1＝19.824 237-6902.652 72 1/T ，｜r｜＝0.991 8，E＝31.58 696 KCal/mol，V298K＝4.581 137×10-4h-1，＝2.49年。
黄芩甙数据处理结果：lgvo2＝20.727 948-7129.837 18 1/T ，｜r｜＝0.985 5，E＝32.626 57 KCal/mol，V298K＝6.343 36×10-4h-1，＝1.80年。

表1 加速破坏实验数据
Table 1 Initial-uniform breaking velocity test data

恒温时间
Thermostatic
time ti
(h) 温度
Temperature
Ti
(K) 绿原酸含量Ci1
Chlorgenic
acid content
(%) 黄芩甙含量Ci2
Baicalin
content
(％)
1 363 93.93 89.08
2 358 94.61 90.96
3 353 95.03 91.87
4 348 95.30 90.53
5 343 96.55 93.35
6 338 97.89 96.32
7 333 99.12 98.26
8 328 99.66 99.28
9 323 99.76 99.75

3 讨论
金银花和黄芩是银黄微型灌肠剂中的主要药物，绿原酸是金银花中比较明确的有效成分之一，黄芩甙是黄芩中比较明确的有效成分之一，因此本文以绿原酸和黄芩甙的含量变化为指标。
待测组分与杂质在本文色谱条件下达到良好的分离效果，所得回归方程满意。表明，应用GX液相色谱法测定银黄微型灌肠剂中主要成分绿原酸和黄芩甙的含量变化是可行的。
采用初均速法测定的绿原酸和黄芩甙活化能数据与文献〔4〕报道27.4 Kcal/mol、27.0Kcal/mol相近，表明预测的有效期可作为控制该制剂质量标准的一个参考数据。